研究背景骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是儿童和青少年最常见的原发恶性骨肿瘤,全世界发病率约为3/100万,占全部骨肿瘤的15%。在导致儿童和青少年的癌症相关死亡原因排名中高居第二位。OS恶性程度高,临床特点为局部浸润和早期的远处血行转移,预后较差。大剂量甲氨蝶呤(HD-MTX)、顺铂和阿霉素作为目前公认的治疗OS的一线首选化疗方案,在传统手术的基础上,极大改善了患者的预后。然而,OS由于其自身的特殊性,容易对化疗药物产生耐药,使得近几十年OS的治疗效果和预后进入瓶颈。阐明并克服OS对不同抗肿瘤药物的耐药机制是当前迫切需要解决的问题。蛋白酪氨酸磷酸酶受体N(protein tyrosine phosphatase receptor type N,PTPRN),也称为胰岛抗原2(IA-2),其编码的蛋白质属于蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)家族,是一种可调控多种细胞过程的信号分子。PTPRN最早被发现在人胰岛β细胞中差异表达,参与胰岛β细胞中胰岛素的分泌,被认为与胰岛素瘤和糖尿病等疾病相关。随着对人类基因组认识的不断深入,近几年来,PTPRN在各类肿瘤中的作用逐渐显现。已有研究报道,PTPRN与包括肺癌、脑胶质瘤在内的不同组织肿瘤的增殖、侵袭、转移等机制密切相关,提示我们PTPRN在肿瘤的生物学行为中同样也发挥着潜在作用。而对于OS而言,PTPRN的相关研究目前尚处于起步阶段,同时,PTPRN对甲氨蝶呤药物敏感性的影响亦无明确定论,这值得我们去探索和发现。研究目的1、在人类全基因组层面,通过CRISPR-Cas9正向筛选影响OS对甲氨蝶呤药物敏感性的重要基因;2、明确PTPRN在OS组织和细胞系中的表达含量;3、探索PTPRN对OS药物敏感性、细胞增殖、迁移Dental biomaterials、凋亡等生物学行为的影响;4、探讨PTPRN影响OS对MTX药物敏感性的分子机制。研究方法1、通过CRISPR-Cas9全基因组文库编辑OS细胞系,采用阴性筛选模式结合二代测序分析,获得实验组和对照组中表达具有明显差异的基因并按差异显著性排序,综合分析后选定具体分子(PTPRN)进行后续实验。通过检索CCLE及GEPIA数据库并分析PTPRN在OS细胞系中相对于其他肿瘤细胞系的表达量以及在泛癌中PTPRN的表达量与患者生存预后之间的关系。通过RT-PCR和Western Blot检测5例OS临床标本肿瘤组织和瘤旁正常组织中PTPRN的表达量,分析PTPRN在OS肿瘤组织和瘤旁组织之间的差异表达情况。采用药物浓度递增法构建对MTX耐药的OS细胞系,通过Western Blot检测OS亲本细胞系及耐药细胞系中PTPRN的表达量,分析PTPRN在OS亲本细胞及耐药细胞系之间的差异表达情况。在MTX短时间刺激后,通过Western Blot检测OS中PTPRN表达量的变化。2、构建PTPRN过表达和干扰的OS细胞系;在体外细胞层面,通过ATP法检测OS细胞对MTX的药物敏感性;通过CCK-8法、克隆形成实验检测OS细胞的增殖能力;通过细胞划痕实验、transwell实验检测OS细胞的迁移能力;通过流式细胞实验及Western Blot实验检测MTX对OS细胞的促凋亡情况;在体内层面,通过裸鼠成瘤实验,进一步验证在OS细胞中PTPRN改变对MTX药物疗效的影响。3、通过转录组学及代谢组学高通量测序,明确OS亲本细胞系及耐药细胞系中基因及代谢物的差异表达情况,联合分析差异基因及代谢物,富集KEGG信号通路。基于转录组学及代谢组学联合分析结果,推测PI3K/AKT/m TOR信号通路和糖酵解代谢途径在OS对MTX的药物敏感性中发挥重要作用。通过Western Blot验证OS细胞在PTPRN过表达和干扰时PI3K/AKT/m TOR信号通路中PI3K、AKT、m TOR等重要分子的表达情况及磷酸化水平变化,同时验证糖酵解相关蛋白(PKM2、LDHA、HK2、GLUT1)的表达量变化以及乳酸、丙酮酸等糖酵解代谢产物量的变化,明确在OS细胞中PTPRN影响MTX药物敏感性的主要分子机制。继而探索在PTPRN表达量改变的情况下,PI3K/AKT/m TOR信号通路和糖酵解代谢途径之间的调控关系,以及PTPRN与PI3K/AKT/m TOR之间的作用方式。最后使用顺铂对PTPRN过表达和干扰的OS细胞系进行药物敏感性研究,明确PTPRN介导的OS细胞耐药性与多药耐药之间的联系。研究结果1、CRISPR-Cas9全基因组筛选及二代测序分析结果显示,在实验组和对照组阴性筛选中,共获得211个具有显著差异的基因,其中PTPRN根据差异显著性综合评分排名前列,考虑可能为OS中影响MTX药物敏感性的重要基因,值得进一步研究和验证。CCLE及GEPIA数据库数据分析结果显示,在所有肿瘤细胞系中,PTPRN在OS细胞系中呈现相对高表达,且在泛癌中PTPRN的表达和患者的不良预后密切相关。RT-PCR和Western Blot实验结果显示与OS瘤旁正常组织相比,PTPRN在肿瘤组织中表达量升高。Saos2和HOS耐药细胞系构建成功,耐药倍数分别为6.19和4.04;Western Blot实验结果显示与OS亲本细胞系相比,OS耐药细胞系中PTPRN的表达量更高。使用不同浓度MTX短时间刺激OS亲本细胞系后,OS中PTPRN的表达量上升。2、体外细胞实验显示,上调PTPRN的表达,能够增加OS细胞系对MTX的耐药性,同时促进OS细胞的迁移能力。相反,下调PTPRN的表达,能够降低OS细胞系对MTX的耐药性,抑制OS细胞的迁移能力,同时可增加MTX对OS细胞系的促凋亡作用。PTPRN改变对OS细胞系的增殖能力无显著影响。裸鼠皮下荷瘤实验显示,在给予MTX治疗的条件下,相比于对照组,干扰PTPRN的OS细胞系形成的肿瘤生长速度和肿瘤体积得到明显抑制。3、转录组学测序结果显示,相比于亲本细胞系,Saos2耐药细胞系中939个基因表达上调,655个基因表达下调;HOS耐药细胞系中2367个基因表达上调,2542个基因表达下调。代谢组学测序结果显示,相比于亲本细胞系,Saos2耐药细胞系中219个代谢物表达上调,203个代谢物表达下调;HOS耐药细胞系中874个代谢物表达上调,931个代谢物表达下调。根据测序所得差异基因和差异代谢物,多组学联合分析并富集KEGG信号通路,其中PI3K/AKT/m TOR信号通路及糖酵解代谢中涉及的相关基因和代谢物差异显著。Western Blot结果显示在OS细胞过表达PTPRN后,PI3K的表达升高且AKT及m TOR磷酸化水平升高,PI3K/AKT/m TOR信号通路被激活,而在OS细胞中干扰PTPRN后,PI3K的表达降低且AKT及m TOR的磷酸化水平降低,PI3K/AKT/m TOR信号通路被抑制。在OS细胞中过表达PTPRN后,糖酵解代谢产物乳酸和丙酮酸产量明显上升,同时糖酵解相关蛋白PKM2、LDHA、HK2、GLUT1都有不同程度的上升。相反,在OS细胞中干扰PTPRN的表达后,乳酸和丙酮酸产量明显降低,且糖酵解相关蛋白PKM2、LDHA、HK2、GLUT1也都有BMS-907351抑制剂不同程度的下降。在使用AKT抑制剂MK-2206或m TOR抑制剂雷帕霉素后,PTPRN过表达引起糖酵解代谢产物产量以及糖酵解相关蛋白表达水平的上调被逆转,同时OS细胞对MTX的耐药性降低。通过基因相关性分析发现在骨组织中,SNAP25与PTPRN存在显著正相关性,Western Blot结果显示在OS细胞中过表达PTPRN后,SNAP25表达升高;在OS细胞中过干扰PTPRN后,SNAP25表达降低。过表达PTPRN可增强OS细胞对DDP的耐药性;干扰PTPRN可减弱OS细胞对DDP的耐药性。结论PTPRN在OS细胞对MTX药物敏感性的调控中发挥重要作用,在OS组织和细胞系中呈现相对高表达,并且在MTX耐药细胞系中表达更显著。过表达PTPRN可增加OS对MTX的耐药性并促进细胞的迁移能力,干扰PTPRN表达则减点击此处弱OS细胞对MTX的耐药性并抑制细胞的迁移能力,同时增加MTX诱导的促凋亡作用,在体内展现出更好的治疗效果。在机制上,PTPRN通过激活PI3K/AKT/m TOR信号通路,进而促进糖酵解代谢,增加OS细胞对MTX的耐药性。同时PTPRN能够增强OS细胞对化疗药物DDP的耐药性,在一定程度上与肿瘤的多药耐药有关。