akt receptor

目的 基于铁死亡相关基因Trichostatin A（FRG）构建骨肉瘤（OS）预后模型，探讨FRG在OS中的表达及与患者预后的关系。方法 通过生物信息学方法从UCSC Xena数据库中获取88例OS患者的转录组测序数据和其中85例患者的临床资料，与基因型-组织表达（GTEx）数据库中获取的396例正常骨组织样本合并，从FerrDb数据库中获取FRG，MRTX849体内实验剂量从合并后的数据中进行差异分析并提取差异表达的FRG。采用基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析探索OS中FRG的生物学功能。采用单因素Cox与Lasso回归模型筛选预后相关基因并构建预后预测模型。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析预后模型的预测价值。采用单因素及多因素Cox回归模型分析OS患者预后的独立影响因素。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测预后相关FRG在人成骨细胞hFOB1.19与OS细胞系U2OS、MG63中的表达情况。结果 共获得57个差异表达的FRG。GO与KEGG富集分析发现这些差异基因主要富集在缺氧反应、线粒体外膜、铁离子结合等生物学反应和线粒体自噬、化学致癌-活性氧以及铁死亡等途径。应用单因素Cox及Lasso回归模型共筛选出9个预后相关的FRG来构建预后模型，分别为酰基辅酶A合成酶家族成员2(ACSF2)、芳香烃受体核转运因子样蛋白（ARNTL）、B细胞淋巴瘤/白血病-2相互作用蛋白3(BNIP3)、脂肪酸去饱和酶2(FADS2)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）、磷酸葡萄糖酸脱氢酶（PGD）、细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS1)、转化生长因子β受体1(TGFBR1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)。ROC曲线和生存分析证实这9个FRG构建的风险模型对OS患者的生存情况具有较好的预测价值。单因素和多因素分析结果显示，转移和风Molecular Biology Software险评分均是OS患者预后的独立影响因素（P﹤0.01）。qPCR结果显示，U2OS和MG63细胞中FADS2 m RNA相对表达量均高于hFOB1.19细胞，差异均有统计学意义（P﹤0.05）;MG63细胞中ACSF2 m RNA相对表达量高于hFOB1.19细胞，差异有统计学意义（P﹤0.05）。结论 本研究成功构建了基于FRG的OS预后模型，发现ACSF2、ARNTL、G6PD、PGD、FADS2、SOCS1、BNIP3、TGFBR1、VEGFA等9个FRG能够作为OS患者的预后生物标志物，可为OS患者的临床治疗和预后评估提供参考。

霍山石斛作为药用石斛中上品，富含柚皮素、芹菜素、槲皮素、夏佛塔苷等类黄Essential medicine酮物质。本研究依据课题组前期的霍山石斛三种不同栽培模式转录组测序数据，筛选并克隆得到霍山石斛类黄酮生物合成途径中显著差异表达的CYP基因(DhuCYP75B1)。运用生物信息学方法对DhuCYP75B1蛋白的结构功能展开分析，结果显示DhuCYP75B1开放阅读框为1 554 bp，编码5Fulvestrant纯度17个氨基酸，终止密码子为TAA，分子量为56.70 kD，理论等电点为6.86，具有跨膜结构域，为亲水酸性蛋白，属于细胞色素P450超家族。系统进化分析表明DhuCYP75B1与兰科小兰屿蝴蝶兰亲缘关系较近，与天南星科的花烛和姜科的姜亲缘关系较远，符合植物分类学特征。此外，实时荧光定量PCR结果显示DhuCYP75B1在叶中的表达量最高，能够响应低温胁迫，并受到茉莉酸甲酯、脱落酸信号调控。本实验结果为进一步研究不同栽培模式下霍山石斛关键酶基因DhuCYP75B1的功能提供了科学依IDN-6556化学结构据。

霍山石斛作为药用石斛中上品，富含柚皮素、芹菜素、槲皮素、夏佛塔苷等类黄Essential medicine酮物质。本研究依据课题组前期的霍山石斛三种不同栽培模式转录组测序数据，筛选并克隆得到霍山石斛类黄酮生物合成途径中显著差异表达的CYP基因(DhuCYP75B1)。运用生物信息学方法对DhuCYP75B1蛋白的结构功能展开分析，结果显示DhuCYP75B1开放阅读框为1 554 bp，编码5Fulvestrant纯度17个氨基酸，终止密码子为TAA，分子量为56.70 kD，理论等电点为6.86，具有跨膜结构域，为亲水酸性蛋白，属于细胞色素P450超家族。系统进化分析表明DhuCYP75B1与兰科小兰屿蝴蝶兰亲缘关系较近，与天南星科的花烛和姜科的姜亲缘关系较远，符合植物分类学特征。此外，实时荧光定量PCR结果显示DhuCYP75B1在叶中的表达量最高，能够响应低温胁迫，并受到茉莉酸甲酯、脱落酸信号调控。本实验结果为进一步研究不同栽培模式下霍山石斛关键酶基因DhuCYP75B1的功能提供了科学依IDN-6556化学结构据。

目的：运用网络药理学及实验验证的方法探讨小补肝汤干预运动性疲劳的有效成分及可能作用机制。方法：在中药系统药理学分析平台（TCMSP）检索小补肝汤的活性成分；通过人类基因组数据库（Genecards）、药物数据库（Drugbank）、在线人类孟德尔遗传（OMIM）、遗传药理学与药物基因组学数据库（PharmGkbbiohybrid system），获取疾病的靶标基因；利用Venny2.1.0在线工具绘制药物与疾病靶点的韦恩图，获得交集靶点，将其导入STRING数据库，构建蛋白相互作用（PPI）网络图，通过Bioconductor等在线软件进行基因组数据的高通量分析，得到基因本体（GO）生物功能注释图和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集通路图，预测作用通路，并采用动物实验验证网络药理学预测结果。结果：通过筛选得到小补肝汤36种活性成分，药物-疾病共同靶点244个；通过构建药物-成分-靶点-疾病调控网络，筛选出豆甾醇（Stigmasterol）、海风藤酮（Kadsurenone）、β-谷固醇（beta-sitosterol）、山蒟酮C（hancinone C）、黄杉素（taxifolin）等核心成分；通过蛋白互作网络的构建，筛选出AKT1、GNAQ、PTGS2等11个关键靶点；GO富集分析得出生物学过程BP 3 点击此处675个，包括对药物的反应、对氧含量的反应、对缺氧的反应、等；细胞组分CC 379个，包括膜筏、膜微区、线粒体外膜、等；分子功能MF 624个，包括DNA-结合转录因子结合、泛素蛋白连接酶结合、G蛋白偶联胺受体活性等分子功能；KEGG富集分析得出涉及的信号通路主要有钙信号通路（GNAQ-PLCB2-IP3R1-CAM）、cAMP信号通路、甲状腺激素信号、等通路。动物实验结果显示，与正常对照组比较，模型对照组负重游泳力竭时间显著减少；血清中乳酸（LD）、尿素氮（BUN）的含量显著升高；肝糖原与肌糖原的含量显著降低（P＜0.01）；骨骼肌组织病理可见骨骼肌细胞排列紊乱不均，有较多炎症细胞弥漫浸润；骨骼肌组织GNAQ、PLCB2、IP3RI、CAM蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。与模型对照组比较，给药组小鼠负重游泳力竭时间明显增加（P＜0.01）；血清中LD、BUN的含量有明显的降低（P＜0.05）；肝糖原与肌糖原的含量有明显升高（P＜LY2157299供应商0.05）；各给药组小鼠骨骼肌纤维排列有所改善，炎性细胞浸润明显减少；骨骼肌组织GNAQ、PLCB2、IP3RI、CAM蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。结论：小补肝汤能抑制运动性疲劳小鼠骨骼肌组织中GNAQ、PLCB2、IP3RI、CAM蛋白表达水平，从而调节胞内钙离子浓度，减轻因钙超载导致的细胞线粒体、肌浆网功能破坏而引起的疲劳。

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)甲基化、血管内皮生长因子(VEGF)在乳腺增生患者中的表达水平及意义。方法 选取2020年1月至2022年3月在涿州市医院就诊的158例良性乳腺增生患者为观察组，同期确诊的158例早期乳腺癌患者为恶性对照组，另选取同期158例体检健康者为健康对照组。对比3组及观察组不同乳腺影像报告与数据系统(BI-RADS)分级患者的PPAR-γ甲基化水平和VEGF水平。采用Spearman相关系数分析PPAR-γ甲基化水平、VEGF水平与BI-RADS分级的相关性，多因素Logistic回归分析影响BI-RVX-661 NMRADSⅣ级乳腺增生进展为乳腺癌的危险因素。结果 观察组PPAR-γ甲基化水平和VEGF水平高于健康对照组，但低于恶性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05);观察组患者随着BI-RADS分级增加，PPAR-γ甲基化水平、VEGF水平呈升高趋势(P<0.05);PPAR-γ甲基化水平、VEGF水平均与BI-RADS分级呈正相关(r=0.836、0.763,均CCRG 81045P<0.001);校正体重指数、初产年龄、绝经、乳房周期性疼痛、每天体育锻炼时间、月经规律、定期体检因素后，Sediment remediation evaluationPPAR-γ甲基化水平及VEGF高表达仍是BI-RADSⅣ级乳腺增生进展的危险因素。结论 乳腺增生患者PPAR-γ基因甲基化水平升高，且VEGF呈高表达，二者与乳腺病变的发生、发展密切相关。

目的 自制高浓度血液样本对MEK-7300P全自动血细胞分析仪进行线性范围的验证。方法 富集多份日常健康献血者血常规标本中的血细胞制成高浓度样本，参照国家卫生行业标准WS/TRegorafenib抑制剂 406-2012、WS/T 408-2012和仪器说明书要求，运用2种方法对MEK-7300P全自动血液细胞分析仪的线性范围进行验证。结果 自制高浓度血液样本的红细胞（red blood cell,RBC）、血红蛋白（hemoglobin,Hb）、红细胞压积（hematocrit,HCT）、白细胞（leukocyte,WBC）和血小板（platelet,PLT）5个项目均通过线性范围的验证，均为一阶线性，且验证范围可覆Caspase抑制剂盖99.9%的日常检测范围。RBC、Hb、HCT、WBC和PLT线性验证数据的不精密度评估值分别为3.10%、3.50%、2.94%、2.55%和1.86%，均小于判定界值8.45%，数据的精密度良好，满足线性评价的要求flamed corn straw。结论 富集日常血常规标本的血细胞样本，可用于验证MEK-7300P全自动血细胞分析仪的线性范围，可满足血站日常工作需求。

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种以持续、反复发作为特征的慢性非特异性肠道炎症,其高发于年轻人、可致残。近年来我国UC发病率持续上升,且趋于年轻化。慢性炎症及其诱发的肠上皮屏障损伤是UC发生发展的关键一环,故抑制肠上皮炎症是UC防治的关键。牡荆素(芹菜素-8-C-葡萄糖苷)是一种C-糖苷类黄酮,具有强效抗炎的作用,在许多药用植物及食物中含量丰富,比如三叶青、山楂、荞麦、甜菜等。此外,与O-糖苷不同,C-糖苷具有相对较高的代谢稳定性,以牡荆素为代表的C-糖苷黄酮可潜在用于防治UC。然而,牡荆素对结肠炎的有益作用及其作用分子靶点尚未报道。组织热蛋白质组分析(Tissue thermal proteome profiling,Tissue-TPP)是动物活体上有效挖掘药物靶点蛋白的新技术,其基于配体诱导靶蛋白热稳定的生物物理原理来检测组织内药物和靶蛋白的结合,在研究活性小分子与蛋白质之间的相互作用上具有明显的优势。本研究首先探讨了牡荆素的体外胃肠道消化稳定性及其在小鼠体内的代谢分布;其次采用DSS诱导小鼠结肠炎症,通过检测medicinal insect体重变化、DAI评分、结肠长度、H&E染色、结肠中炎症因子及屏障蛋白表达,研究牡荆素抗结肠炎症并缓解屏障损伤的作用;最后通过Tissue-TPP结合分子对接技术鉴定牡荆素的潜在蛋白靶点,并基于TNFα诱导的Caco-2细胞炎症模型,采用si RNA基因沉默技术进一步明确该蛋白靶点是否介导了牡荆素抗炎及其作用机制。旨在为活性小分子新靶点的挖掘提供新思路,并为以牡荆素为起点开发膳食补充剂或药物高效防治炎症性疾病提供科学依据。主要研究结果如下:1.在体外模拟胃肠道消化时,牡荆素的含量未见显著改变;同时在37℃条件下,牡荆素以10μmol/L的初始浓度与大鼠血浆共孵育8 h后,仍未被降解,表明其经胃肠道消化及在血浆中具有很好的稳定性。此外,在小鼠灌胃牡荆素0.5h后,牡荆素就以原型的形式被吸收并进入到血液中,随后分布到心脏、肝脏和肾脏中,在4 h时牡荆素在结肠组织中的含量达到峰值,8 h后,其浓度虽然很低,但仍能被检出。然而,除了牡荆素外,其糖苷配基(芹菜素)及已报道的小分子酚酸代谢物(比如:3-(4-羟基苯基)丙酸、苯乙酸和3-苯基丙酸)均未被检测到,推测牡荆素的代谢很可能由特定菌群完成,而在小鼠肠道中并没有定植该类菌群。2.与DSS模型组相比,牡荆素处理显著阻止了小鼠体重的减轻、结肠长度的缩短、血便及粪便中含水量的增加,并使小鼠的疾病指数评分明显下降。H&E染色结果显示,与DSS组相比,牡荆素处理组的结肠隐窝较完整,炎性浸润范围较小。结肠中炎症因子(IL-1β、IL-6、ICAM和VCAM)的表达在经DSS诱导后显著增加,而经牡荆素处理后,上述炎症因子在蛋白和基因水平均明显降低。此外,与DSS组相比,牡荆素处理组血清TNFα和IL-1β的水平显著降低。免疫荧光及免疫印迹的结果显示,牡荆素可显著上调结肠屏障相关蛋白(Occludin、ZO-1和E-cadherin)的表达。上述结果表明,牡荆素可缓解小鼠结肠炎症及改善肠道屏障功能。3.为进一步鉴定牡荆素的抗炎作用靶点,通过Tissue-TPP技术筛选出5个与DSS组相比SDS-PAGE灰度值显著增强的蛋白条带,并利用质谱技术共鉴定到2785个蛋白,其中14个蛋白的Score>50、Unique peptides>10、Abundances>10~8。分子对接的结果表明,牡荆素与这1Liraglutide作用4个蛋白的结合能较低(<-5 kcal/mol),表明牡荆素对这14个蛋白有很强的亲和力,其中有8个蛋白(OLA1、Fahd1、Sdha、Rpn1、Acad9、Ass1、Txndc5、Wdr1)与牡荆素的结合能低于-7 kcal/mol,为牡荆素的候选靶点蛋白。值得注意的是,转录因子Nrf2是活性小分子发挥抗炎作用的关键蛋白,免疫荧光及Western blotting的结果显示牡荆素可显著提高结肠组织中Nrf2蛋白的表达。鉴于Keap1是Nrf2活化的关键,进一步利用HDOCK在线蛋白-蛋白互作软件探究上述8个候选蛋白-牡荆素复合物与Keap1蛋白的相互作用,发现OLA1和Fahd1能通过疏水作用、氢键等非共价键结合到Keap1的活性空腔上,且牡荆素位于该活性空腔中,提示OLA1-牡荆素复PD-0332991小鼠合物和Fahd1-牡荆素复合物很可能通过与Keap1结合,阻断Keap1-Nrf2复合物的形成,进而使Nrf2解离活化并抗炎。综合HDOCK对接评分及RMSD值,最终选择OLA1作为牡荆素的候选靶点蛋白,进一步的组织热位移证明了牡荆素与OLA1的结合,同时免疫荧光共定位结果证明了OLA1与Nrf2的相互作用。采用si RNA技术沉默OLA1基因的表达,发现牡荆素失去了上调Nrf2蛋白表达及抑制IL-1β和ICAM等炎症因子表达的能力。热邻近共聚结果表明,牡荆素处理后,除OLA1蛋白热稳定性增强外,OLA1和Keap1蛋白还表现出相似的熔解曲线。这些结果提示,OLA1是牡荆素的直接作用靶点,其很可能通过与Keap1互作并激活Nrf2进而抑制肠道炎症。综上所述,牡荆素在体外模拟胃肠消化和血浆共孵育过程中均表现出极强的稳定性,并可在结肠组织中大量富集;牡荆素缓解了DSS诱导的结肠炎小鼠的临床症状和结肠损伤,同时抑制结肠中炎症细胞因子的表达,促进肠道屏障蛋白的修复;OLA1作为牡荆素的直接作用靶点,与牡荆素结合后与Keap1发生相互作用,阻断Keap1与Nrf2的结合,从而使Nrf2入核,抑制炎症细胞因子的表达。

目的：分析良性前列腺增生患者经尿道刀口变向钬激光前列腺剜除术（HoLEP）与经尿道直射HoLEP的临床疗效。方法：随机选取2021年SAHA纯度8月～2022年8月本院临床收治的良性前列腺增生患者54例，采用随机分组法将患者分为观察组和对照组，观察组实施经尿道刀口变向HoLEP，对照组实施经尿道直射HoLEP，对比两组患者手术相关指标、炎性因子水平以及术后生活质量，并进行分析。结果：观察组患者手术时间、住院时间、血红蛋白下降以及膀胱冲洗时间均低于对照组患者，组间有统计学意义（P<0.05），两组患者术中切除组织重量、导尿管留置时间不具有统计学意义（P>0.05）；治疗前，组间不具有统计学意义（P>0.05Peptide Synthesis），观察组患者治疗后炎性因子（C反应蛋白、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6）水平明显更低（P<0.05）。结论：经尿道刀口变向HoLEP以及经尿道直射HoLEP手术治疗方式均为治疗良性前列腺增生患者的有效Q-VD-Oph试剂手段，但经尿道刀口变向HoLEP能缩短患者手术时间，降低患者术后炎性因子水平。

【目的】通过对因子宫良性病变行全子宫切除术或次全子宫切除术同时预防性切除输卵管患者的病理资料进行分析,并结合Ki67、p53蛋白在输卵管组织的表达情况,探讨行预防性输卵管切除的临床应用价值和意义。【方法】1.收集并回顾性分析昆明医科大学第一附属医院妇科2018年1月至2022年12月期间收治的因子宫良性病变(如子宫平滑肌瘤、子宫腺肌病、子宫内膜非典型增生、CINIII等病变)行全子宫或次全子宫切除术同时行输卵管切除术的1187例患者临床病理资料,分析术后输卵管组织的病理特征。2.将2022年1月至2022年12月在昆明医科大学第一附属医院妇科收治的因子宫良性病变行全子宫或次全子宫切除术同时行输卵管切除的患者中210例患者的输卵管通过免疫组织化学SP染色法检测细胞核相关抗原Ki67和p53在输卵管中表达情况,分析术后输卵管组织p53和Ki67表达水平以探讨在因子宫良性病变切除子宫时预防性切除输Automated Workstations卵管的临床意义。【结果】1.1187例行输卵管预防性切除的患者中平均年龄(47.53±3.85)岁,均为未绝经患者。其中1139例(95.96%)行双侧输卵管切除术,48例(4.04%)行单侧输卵管切除术(另一侧因输卵管异位妊Emricasan娠、绝育术等原因已行切除)。共计切除输卵管2326条,术后病理结果为2183条(93.85%)输卵管伴有慢性输卵管炎症,822条(35.34%)输卵管伴系膜副中肾管囊肿,100条(4.30%)输卵管存在间质出血或水肿,48条(2.06%)输卵管未见明显异常或呈萎缩性改变,26条(1.12%)输卵管见Walthard巢,15条(0.64%)输卵管伴积液(其中13条输卵管积水,2条为输卵管积脓),12条(0.52%)输卵管上观察到子宫内膜异位灶,10条(0.43%)输卵管低级别上皮内瘤变,9条(0.39%)伴有急性输卵管炎症,6条(0.26%)输卵管有上皮或淋巴组织增生表现,6条(0.26%)输卵管为肉芽肿性炎,2条(0.08%)输卵管上皮化生,1条(0.04%)输卵管见Brenner巢,未见输卵管恶性肿瘤的发生。并且还发现在10条输卵管呈低级别上皮内瘤变患者中,双侧的输卵管均普遍出现明显慢性或急性炎症病变。2.将其中210例患者通过免疫组织化学SP染色法检测细胞核相关抗原Ki67和p53在预防性切除的输卵管组织中表达情况,其中行双侧输卵管切除术205例,单侧输卵管切除术5例。共切除输卵管415条。免疫组化结果为300条输卵管P53为阴性,115条输卵管P53为阳性且均为野生型,未见p53突变型表达。14条输卵管Ki67为阴性,其余401条Ki67均有表达,染色面积均不大于20%,均为弱表达。【结论】1.绝大多数预防性切除的输卵管均合并不同程度GSK1349572小鼠的输卵管炎症,预防性切除输卵管可除去输卵管炎性病变,从而消除诱发肿瘤的因素之一;2.预防性切除输卵管消除了残留输卵管并发症的发生,一定程度上降低二次手术率。

早发性卵巢功能不全(Premature ovarian insufficiency,POI)是指女性40岁之前出现卵巢功能减退,是一种难防难治的生殖障碍性疾病。POI的发病率约为3.7%,呈上升趋势,严重影响着女性的身心健康。大多数女性患者临床就诊时卵巢功能已经发生不可逆转的衰竭,但目前尚无有效的治疗策略改善或恢复卵巢功能。因此,POI的病因学研究对于其早期预警、诊断和干预具有重要意义。POI的病因高度异质,包括遗传缺陷、自身免疫异常、感染、医源性因素以及环境因素等,然而约半数的POI患者病因仍不明确。因此,通过遗传学筛查明确病因并探索POI的发病机制,是实现POI早诊早治的关键。转录因子p63基因(在人类中命名为TP63)是p53家族成员之一,其编码的TAp63α蛋白亚型特异性地表达于原始卵泡的卵母细胞中。在生理情况下,TAp63α 的 C 端转录抑制结构域(Transactivation inhibitory domain,TID)和 N 端转录激活结构域(Transcriptional activation domain,TAD)相互结合,形成失活的封闭二聚体。当卵母细胞发生DNA损伤时,TAp63α发生磷酸化,从失活型二聚体变为激活型四聚体,从而诱导细胞凋亡,起到卵母细胞质量控制因子的功能,从而维持女性生殖细胞的基因组完整性。在既往研究中,少数病例报道发现TP63突变可能通过影响TAp63α的功能导致POI的发生。但存在样本量小、表型差异大且缺乏系统功能研究等局限性,该基因变异对POI的遗传贡献度以及基因型与表型的相关性仍缺乏大样本临床证据和机制研究的支持。目acute oncology的阐明TP63基因突变在POI发病中的作用及分子机制。方法首先,基于课题组前期构建的1030例POI-全外显子组测序(Whole exon sequencing,WES)数据库,对TP63基因进行突变筛查、验证、致病性预测及突变位置分析;在SAOS-2细胞(人骨肉瘤细胞系,无内源性TP63基因表达)中过表达野生型与突变型TAp63α质粒,行Western blot、BN-PAGE检测野生型与突变型TAp63α蛋白的表达及聚合状态,并通过Co-IP实验检测突变型TID与TAD的结合变化,明确突变型TAp63α蛋白聚合状态改变的原因;进一步行双荧光素酶报告实验、凋亡相关蛋白BAX和TUNEL检测,比较野生型与突变型TAp63α的转录活性及对SAOS-2细胞凋亡的影响,明确突变对TAp63α活性和功能的影响。为了进一步明确TP63基因功能缺陷在POI发生中的作用机制,我们首先构建了 TID缺失(p63~(+/ΔTID))小鼠,通过对p63~(+/ΔTID)小鼠的生育力及生殖系统表型进行观察,明确TID缺失对雌性生殖系统的影响;同时,对p63~(+/ΔTID)小鼠卵巢行凋亡标志物Cleaved-PARP1的免疫荧光染色,Western blot检测凋亡蛋白BAX的表达水平,qRT-PCR检测凋亡相关靶基因Puma及Noxa的mRNA表达水平,明确TID缺失的小鼠卵母细胞是否通过凋亡途径迅速耗竭;在SAOS-2细胞中分别转染小鼠野生型p63和突变型p63ΔTID质粒,检测p63蛋白的表达水平、聚合状态以及对下游凋亡相关靶基因转录的作用,进一步揭示p63ΔTID发挥作用的机制。最后,为了明确源于临床患者的TP63基因点突变的致病性,我们构建了 TID点突变(p63~(+/R647C))小鼠,通过对p63~(+/R647C)小鼠的生育力及生殖系统表型进行观察,确定TID点突变对雌性生殖系统的影响;同时,通过对p63~(+/R647C)小鼠卵巢凋亡标志物Cleaved-PARP1的免疫荧光染色,明确TID点突变小鼠卵母细胞是否通过凋亡途径耗竭;此外,由于p63~(+/R647C)小鼠生殖缺陷表型轻于p63~(+/ΔTID)小鼠,通过观察p63~Trichostatin A分子量(+/R647C)小鼠卵母细胞的第一极体排出率、纺锤体形态(α-tubulin的免疫荧光染色)、线粒体膜电位(JC-1染色),进一步评估点突变小鼠幸存卵母细胞的质量。结果1.TP63基因突变筛查及体外功能研究在1030例POI患者中发现11名患者携带9个TP63基因杂合突变p.S285N、p.T538A、p.T567I、p.Q568fs*3、p.R594*、p.R643Q、p.L646P、p.R647C和p.R655Q,并通过Sanger测序验证。其中大部分突变位于TAp63α的C端,包括导致TID功能域丢失的截短突变(p.Q568fs*3、p.R594*)和位于TID核心序列内的点突变(p.R643Q、p.L646P、p.R647C和p.R655Q)。这些突变位点在物种间高度保守,多种软件预测为可能致病变异。在SAOS-2细胞中过表达野生型与突变型TAp63α质粒,发现影响TID功能域的 6 个突变型蛋白(p.Q568fs*3、p.R594*、p.R643Q、p.L646P、p.R647C 和p.R655Q)由失活的二聚体构象转变为活性四聚体。其中,p.Q568fs*3、p.R594*直接导致TID的缺失,而p.R643Q、p.L646P、p.R647C和p.R655Q突变体损害了 TID与N端TAD的结合作用。同时,这6个TID受损的突变体激活了下游凋亡相关靶基因NOXA、PUMA和BAX的表达,导致细胞凋亡增加。这些结果提示影响TID功能的突变具有致病性。2.p63~(+/ΔTID)小鼠POI样表型分析及相关机制研究成年p63~(+/ΔTID)雌鼠完全不育,卵巢萎缩。卵巢组织HE染色结果显示,出生后1天(P1)p63~(+/ΔTID)小鼠卵泡大量丢失。卵泡计数结果表明,胚胎18.5天(E18.5)时p63~(+/ΔTID)小鼠卵母细胞数量与野生型小鼠相比没有明显差异,而P1时数量减少至野生型小鼠的约40%,P10时完全丢失。进一步分析P1p63~(+/ΔTID) 小鼠卵巢中卵母细胞的凋亡情况,免疫荧光染色结果显示p63~(+/ΔTID)小鼠卵巢中Cleaved-PARP1阳性的卵母细胞比例显著增加。同样,Western blot和qRT-PCR检测结果表明,p63~(+/ΔTID)小鼠卵巢中Bax蛋白表达增加,Puma和Noxa的mRNA水平升高。此外,通过BN-PAGE检测到在SAOS-2细胞中过表达的p63ΔTID突变体形成活化四聚体,双荧光素酶报告实验结果显示p63ΔTID激活下游PUMA、NOX4和BAX基因的转录。3.p63STM2457化学结构~(+/R647C)小鼠POI样表型分析及相关机制研究成年p63~(+/R647C)雌鼠生育力下降,卵巢体积明显减小。卵巢组织HE染色结果显示,p63~(+/R647C)小鼠卵巢中卵泡大量丢失,P10p63~(+/R647C)小鼠卵母细胞减少至野生型小鼠的约50%。进一步行Cleaved-PARP1免疫荧光染色,结果显示p63~(+/R647C)小鼠卵母细胞凋亡比例显著增加。同时,除了在p63~(+/R647C)小鼠中观察到卵母细胞丢失外,其剩余的存活卵母细胞第一极体排出率降低,异常纺锤体率增高且线粒体膜电位下降,提示卵母细胞质量受损。结论本研究基于大样本临床病例突变筛查和系统性体内外功能研究,揭示了TP63基因功能获得性突变导致TAp63α蛋白C端的TID功能受损,引起TAp63α蛋白异常激活,导致卵母细胞病理性凋亡并最终发展为POI的分子机制,为女性特别是肿瘤放化疗患者的生育力保护提供了理论依据和干预靶点。