akt receptor

试验以0.81 g凡纳滨对虾仔虾为对象，研究在盐度30 mg/kg条件下饲料糖脂比对凡纳滨对虾生长、生理生化指标及体组成的影响。试验配制6种等氮等能饲料，蛋白水平为41%，糖脂比分别为4.01∶1、3.29∶1、2.78∶1、2.21∶1、1.75∶1、1.42∶1。每组设3个重复，每个重复30尾虾。结果显示：(1)投喂糖脂比为3.29∶1的饲料组凡纳滨对虾成活率显著高于糖脂比为2.21∶1、1.42∶1的饲料组（P<0.05）。投喂糖脂比为2.78∶1的饲料组凡纳滨对虾特定生长率显著高于糖脂比为4.01∶1、3.29∶1的饲料组（P<0.05）。(2)投喂糖脂比为4.01∶1的饲料组凡纳滨对虾淀粉酶活性显著高于糖脂比为1.75∶1、1.42∶1的饲料组（P<0.05medical equipment）。投喂糖脂比为4.Histone Methyltransf抑制剂01∶1的饲料组凡纳滨对虾己糖激酶活性显著高于其余各组。投喂糖脂比为3.29∶1的饲料组凡纳滨对虾肝糖原显著高于糖脂比为1.42∶1的饲料组（P<0.05）。(3)投喂糖脂比为1.42∶1的饲料组凡纳滨对虾血蛋白浓度显著高于糖脂比为1.75∶1的饲料组（P<0.05）。投喂糖脂比为4.01∶1的饲料组凡纳滨对虾血糖https://www.selleck.cn/products/Gemcitabine-Hydrochloride(Gemzar).html含量显著高于糖脂比为1.42∶1的饲料组（P<0.05）。(4)投喂糖脂比为1.42∶1的饲料组凡纳滨对虾胆固醇含量显著高于糖脂比为4.01∶1、3.29∶1、2.78∶1、2.21∶1的饲料组（P<0.05）。投喂糖脂比为1.42∶1的饲料组凡纳滨对虾三酰甘油含量显著高于糖脂比为4.01∶1和2.21∶1的饲料组（P<0.05）。投喂糖脂比为1.42∶1的饲料组凡纳滨对虾粗脂肪含量显著高于糖脂比为4.01∶1、3.29∶1、2.78∶1的饲料组（P<0.05）。试验结果表明，凡纳滨对虾最适淀粉和脂肪需求分别为18.97%和6.83%，最适糖脂比为2.78∶1。

魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan,KGW-572016 IC50GM）可被β-葡聚糖酶降解，对其降解产物的结构特性进行了研究。利用X射线衍射、傅里叶变换红外光谱、扫描电子显微镜鉴定KGM及其酶解产物的结构特征变化，并结合多角度激光光PF-03084014散射-凝胶渗透色谱法测定KGM及其产物的分子质量，测定其特征黏度、脱乙酰度、可溶性多糖含量、电学特性等对酶解产物进行化学特性评hereditary breast估。结果表明：与原KGM相比，KGM酶解产物的主链结构没有改变，原KGM经过5倍酶量酶解120 min后，可能存在较弱的结晶区，扫描电子显微镜结果显示酶解产物表面片层化，且分子质量减小至（36.48±1.23）kDa，特征黏度减小了98%，脱乙酰度显著增大（P<0.05），可溶性总糖含量显著降低（P<0.05）。本研究可为KGM酶解改性的应用提供参考，促进KGM酶解产物资源的高价值利用。

目的：探讨非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）LXH254生产商SMARCA4突变患者临床特征及预后，并应用生物信息学方法探究其临床意义。方法：回顾性分析35例SMARCA4基因突变NSCLC患者临床资料，根据伴随基因突变类型分组，采用Kaplan-Meier法行生存分析。应用TIMER数据库、GEPIA数据库分析SMARCA4基因在NSCLC及正常肺组织中的表达差异。cBioPortal数据库分析SMARCA4基因突变情况及与预后的相关性。STRING数据库构建SMARCA4相互作用蛋白网络。结果：SMARCA4突变NSCLC患者以老年男性为主，主要biotic index病理类型为腺癌；主要伴随突变基因有EGFR(14例)、TP53(11例)、KRAS(4例)、ERBB2(4例)等。生存分析发现伴随EGFR突变患者预后较野生型好，而伴随KRAS突变患者预后较野生型差。生物信息学分析发现8%的NSCLC患者携带SMARCA4基因突变，突变类型包括错义突变、剪接突变、删除突变等；含SMARCA4突变的肺腺癌患者预后较野生型差。结论：SMARCA4突变影响NSCLC患PLX4032溶解度者预后，且伴随基因种类对患者预后产生不同影响，这为肺癌的精准化治疗提供更多依据。

在最近的几十年里,纳米技术是一个新兴的科学领域,取得的成果有力地推动了纳米粒子的创新性设计与合成。通过改变纳米粒子结构、尺度、形状和组成,可以赋予其丰富的特定性能。在实际应用中,研究人员将刺激响应因素与纳米粒子结合,制备出多种响应型纳米粒子。相关内部微环境刺激与外界刺激源也多种多样,根据刺激类型,可将其分为p H响应、温度响应、光响应、电场响应、磁场响应、声响应、氧化还原响应、酶等生物分子响应、气体响应等响应型纳米粒子。对各种物理、化学刺激实现特异性响应的纳米粒子在催化、光电器件、标志物检测、环境Genetic alteration保护、能源产生/储存、电子传感、生物医药等方面都有广泛的应用。尤其在生物医药方面,纳米级尺寸使其具有穿透性、扩散性有利于体内非侵入性摄取。功能基团多使其易修饰功能化,引入包载性、响应性、特异性。在诊断检测疾病、药物输送系统、新型生物医药等具体应用都取得了先进的研究成果。针对体内疾病的微环境变化,引入对内源信号具有新型、多重、个性化响型的响应型纳米粒子,有助于发挥更智能、更显著的作用,具有重要意义和应用前景。本文以响应型多功能纳米粒子的设计制备为主线,以生物医学成像、检测、治疗的功能为目标,针对不同疾病治疗需求及体内应用环境,设计具有智能响应型特征的纳米粒子,研究其在解决肿瘤诊疗等重要医学难题方面的实际应用潜力和科学意义。首先,制备了一种光激发响应型荧光成像的金纳米簇探针Au-GSH,用于高稳定性地神经成像。通过电化学刻蚀法制备的Au-GSH具有均匀的尺寸和先进的荧光光物理特性,满足神经科学领域荧光探针几个严格的标准,包括水溶性好、明显的信号背景比、抗光漂白性和高生物相容性。对比传统的荧光蛋白、量子点和有机荧光染料等其它种类的探针,Au-GSH更适宜于长期体内激发响应性荧光成像并示踪显影神经组织。这种金纳米簇发射出明亮的红色荧光,避免了自体组织蓝色荧光的干扰,能对体内神经和脑组织进行荧光标记和示踪,可视化地点亮神经,避免手术中对神经的损伤。其次,设计了一种抗原响应型金簇-抗体探针Au-TTF-1,获得针对肺腺癌的靶向识别、多模式成像和诊疗一体化方面的应用。肺腺癌是死亡率与发病率最高的癌症,因此早期检测和治疗具有重要意义。设计将肺腺癌的特异性识别抗体TTF-1与金纳米簇偶联,构筑抗原响应型探针。该探针有优异的荧光性能,且肺腺癌靶向性达70.1%,是正常细胞的3倍。进一步利用机器学习软件设计了对肺腺癌辅助检测的图像分析系统,深度学习后能有效智能区分肺腺癌细胞和正常细胞。体内实验结果表明,Au-TTF-1不仅快速在0.5 h内靶向肺腺癌荧光可视化照亮肿瘤边界,还能通过多模式成像指导并实施后续的无创光热治疗,在体内局部消融肿瘤。这种金簇-抗体探针Au-TTF-1,能通过抗原响应性主动VX-661抑制剂靶向肺腺癌进行成像和治疗,在肿瘤的诊疗一体化方面具有重要的应用价值。再次,我们通过对金簇表面基团功能化修饰,设计制备了近红外光NIR/p H响应型金簇-水凝胶复合材料,实现针对骨肉瘤化疗和光热的协同治疗。为了解决骨肉瘤常规治疗方法通常引起骨基质损伤的难题,受莲蓬的启发,我们构筑了金簇-水凝胶复合材料,注射在骨肉瘤病灶部位并实现局部响应释放药物,获得化疗和光热的协同治疗效果。一方面,金簇作为仿莲蓬结构的核心莲子,提供了增强、持久、可重复性的光热治疗能力及荧光/CT多模式成像功能。另一方面,修饰的金簇通过动态共价键与天然高分子链段形成可注射凝胶复合材料,获得仿莲蓬的柔性支架结构,能装载并智能释放化疗药物阿霉素。利用骨肉瘤的酸性p H微环境促进水凝胶动态共价键降解释放阿霉素,同时光热引起的升温加速化疗药物阿霉素在瘤间持续释放。这种利用金簇-水凝胶复合材料不仅显著降低化疗药物的全身毒性,同时能有效地消融骨肉瘤,开辟了深层次肿瘤治疗的新途径。最后,设计制备了具有X-ray响应性的二硒键桥联Si O_2纳米粒子(MSN),包载光敏剂吖啶橙(AO)用于宫颈癌的放射动力治疗。针对宫颈癌这种深层次肿瘤的放疗容易导致辐射抗性的医学难题,本章工作设计构筑的MSN可以装载放疗光敏剂吖啶橙(AO)制成MSN@AO。由于微球具有高比表面积和孔隙空间,能获得较高的AO包覆率83.2%。在X-ray辐射和肿瘤微环境具有高过氧化氢浓度的条件下,二硒键断裂导致MSN降解,在肿瘤原位释放AO,释放率达85%。特别是,在低剂量X-ray作用下就能激活光敏剂AO,发挥放疗增敏和放射动力治疗特性。通过产生ROS,达到降低宫颈癌细胞增殖活性、抑制DNA损伤修复、损伤线粒体、促进癌细胞凋亡。获得了较低辐射剂量下消融肿瘤的显著效果,同时辅助解决了宫颈癌辐射抗性的问题。这种纳米粒子MSN@AO设计,一方面解决了单纯AO治疗引起的药物快速清除、不良分布和副作用等问题。另一方面,充分利用了X-ray的优势,在肿瘤局部智能响应释药,在较低辐射剂量下获得放疗增敏、放射动力治疗的多重功能,达到消融肿瘤的目的。这种纳米粒子将在宫颈癌等深层次癌组织治CL 318952疗方面具有优异的应用前景。

目的:维生素K是人体必需的脂溶性维生素,其在促进凝血、维持骨骼健康和预防动脉粥样硬化等方面的健康效应日益受到关注。然而,目前尚无公认的指标和相应的参考范围来评估不同人群的维生素K营养状况。本研究旨在建立中国健康育龄女性维生素K营养评价指标的参考范围,为维生素K营养评价提供依据。方法:本研究共纳入631名健康育龄女性(18-49岁)作为参考人群,所有受试者均来自2015-2017年中国成人慢性病和营养监测(CACDNS)。选择文献报道较多的一系列可用于维生素K营养状况评价的指标进行检测,采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测血清中维生素K(VKnon-necrotizing soft tissue infection1、MK-4和MK-7)的浓度,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定评估维生素K营养状况的其他常用指标,此网站包括羧化不全骨钙素(ucOC)、骨钙素(OC)、基质Gla蛋白(MGP)、非磷酸化未羧化MGP(dp-ucMGP)和维生素K缺乏诱导蛋白II(PIVKA-II),计算羧化不全骨钙素比例(%ucOC)。通过计算参考人群中维生素K评价指标的P2.5-P97.5区间获得参考范围。结果:血清中VK1、MK-4和MK-7的参考范围分别为0.21-3.07 ng/mL、0.02-0.24 ng/mL和0.12-3.54 ngPF-02341066/mL。ucOC、%ucOC、dp-ucMGP和PIVKA-II的参考范围分别为1.09-2.51 ng/mL、5.80-22.78%、2.69-5.88 ng/mL和3.98-8.40 ng/mL。结合各项指标的参考范围及其生理意义,提出可用于评估亚临床维生素K缺乏的界值如下:VK1<0.21 ng/mL,MK-7<0.12 ng/mL,ucOC>2.51 ng/mL,%ucOC>22.78%,dp-ucMGP>5.88 ng/mL,PIVKA-II>8.40 ng/mL。结论:本研究建立的健康育龄女性维生素K营养状况评价指标的参考范围可用于评估该人群的营养和健康状况。

碳代谢阻遏(carbon catabolite repression,CCR)是广泛存在于细菌和真菌中的调控机制,对碳代谢相关酶类如纤维素酶表达的调控起到了抑制作用,其关键转录因子为碳代谢抑制子Mig1/Cre A/CRE1。白腐菌具有丰富的降解木质纤维素酶系,在碳循环中发挥重要的作用,探究其CCR机制有助于明确白腐菌的碳代谢过程以及综纤维素分解抑制与木质素分解之间的关系,为白腐菌的木材分解机制奠定理论基础。偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)是多孔菌科(Polyporacceae)的一种白腐菌,生长速度快,具selleck合成有较强的木质纤维素分解能力。本研究利用同源重组法构建偏肿革裥菌CRE1蛋白基因的敲除突变体菌株,并对突变体菌株的生长发育、纤维素酶基因的转录表达进行检测分析,从而探究白腐菌碳代谢抑制子CRE1的功能,旨在为揭示白腐菌的碳代谢阻遏机制奠定基础。主要研究结果如下:1.克隆得到编码偏肿革裥菌Lg-CRE1蛋白的基因Lg-cre1,其长度为2148 bp。对Lg-CRE1蛋白进行系统发育和motif分析,其与子囊菌的相关蛋白的序列长度和保守序列差异较大,某些motif位置发生了变化(如motif 3、motif 5、motif 8、motif 12),缺失了某些motif(如motif 2、motif 14、motif 16),添加Medulla oblongata了某些motif(如motif 7、motif 10、motif 11、motif 15、motif 17、motif 18、motif 19),而与担子菌中的其他物种相关蛋白的同源性很高;对Lg-CRE1蛋白磷酸化位点进行预测和分析,获得了2个可能起到关键作用的磷酸化位点S151和S493;对Lg-CRE1蛋白进行理化性质分析,结果表明,Lg-CREE-616452分子量1由715个氨基酸组成,蛋白分子量约为76.52k Da,理论等电点为9.24,不稳定指数(Ⅱ)为69.88,为不稳定蛋白。Lg-CRE1蛋白二级结构中α-螺旋占比23.08%,延伸链占比7.97%,β-转角占比4.90%,无规卷曲占比64.06%。2.从基因组中选择Lg-cre1基因上游序列1222bp,下游序列1261bp,利用同源重组原理在潮霉素抗性基因两端构建敲除载体P-Δcre1。并进行PEG介导的原生质体转化,经过筛选,稳定遗传,获得了偏肿革裥菌Lg-cre1基因突变体。对其形态进行观察,发现在固体的完全培养基、羧甲基纤维素钠培养基和杨木粉葡萄糖培养基上培养时,突变体菌株的生长速率均低于野生型,菌丝稀疏;在液体完全培养基上培养时,生长初期突变体菌丝相较野生型比较松散。3.对Lg-cre1突变体和野生型菌株进行了不同处理条件下的RT-q PCR分析及生理测定。在2%羧甲基纤维素钠液体培养条件下,突变体中内切葡聚糖酶基因eg1、β-葡萄糖苷酶基因bg1、外切葡聚糖酶基因cbh1-2基因表达量显著增加,最高分别为0d的171.57倍、103.29倍和39.95倍,而W-eg2、bg2和cbh1-1基因表达量差异不大。突变体中β-葡萄糖苷酶活性最高是野生型的5.42倍,而二者滤纸酶活性、内切葡聚糖酶活性、外切葡聚糖酶活性和胞外蛋白含量差异不明显。综上所述,碳代谢抑制子Lg-CRE1为C_2H_2型锌指转录因子,具有两个C_2H_2锌指结构域,本研究表明了偏肿革裥菌的碳代谢抑制子Lg-CRE1具有两项功能:对纤维素酶基因表达具有抑制作用;对偏肿革裥菌的生长发育具有正向调控的作用。

目的 探讨术前12 h应用低分子肝素钙在游离股前外侧皮瓣移植术中的临床疗效。方法 选取50例手、足部皮肤软组织缺损行游离股前外侧皮瓣移植术修复的患者为研究对象,随机分成观察组(26例)和对照组(24例)。观察组术前12 h开始使用低分子肝素钙,术后4 h继续常规使用；对照组术后4 h开始常规使用MLN4924供应商低分子肝素钙。比较两组术后皮瓣成活率、皮瓣血管危象发生率及术后出血性事件发生率。结果 随访3个月后,两组共行游离皮瓣52块,其中2例为双侧股前外侧皮瓣移植。(1)皮瓣成活率：观察组26例患者中, 25例皮瓣全部成活, 1例出现皮瓣尖端部分坏死,皮瓣成活率为96.2%。对照组24例患者中,所有皮瓣均成活,未出现皮瓣坏死现象,皮瓣成活率为100.0%。两组皮瓣成活率比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)血管危象发生率：观察组26例患者均未出现血管危象并探查情况,血管危象发生率为0；对照组1例患者发生2次血管危象,经2次探查后成活,其他23例患者均未发生血管危象,血管危象发CBT-p informed skills生率为4.2%,两组血管危象发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。两组均未发生术后出血性事件。结论 术前12 h开始使用低分子肝素钙对比术后4 h开始使用低分子肝素钙对皮瓣成活率、皮瓣血管危象发生率的影响无明显差异,术前12 h或术后4 hColforsin试剂开始使用低分子肝素钙均不会增加术后出血性事件发生率。

目的:通过对4例植物固醇血症先证者血清植物固醇浓度的检测、家系调查及基因测序,明确先证者的基因缺陷特点及家系遗传特点。对一例ABCG8基因内含子突变的致病机制进行研究。方法:第一部分:收集4例先证者的临床资料,同时进行家系调查。采集先证者的外周血,进行血清植物固醇浓度检测,同时提取外周血基因组DNA,通过基因测序,明确致病基因突变位点,并对家系成员进行基因突变验证。第二部分:采用Minigene技术对其中一例先证者ABCG8基因c.322-2A>G突变进行致病性分析。明确内含子突变对RNA剪接的影响后,通过真核表达载体验证ABCG8基因c.322-2A>G突变对蛋白的影响。结果:第一部分:1、本研究共诊断4例植物固醇血症患者,2例患者父母为近亲婚配。4例先证者血常规均有贫血及血小板减少,网织红细胞升高,有溶血性贫血的表现。外周血涂片提示其中4例可见口形红细胞,3例患者见巨大血小板;4例先证者均有脾大,其中3例可见胆红素及转氨酶轻度升高,有2例患者有心血管累及,有1例患者出现了黄色瘤;4例患者骨髓细胞学提示均为增生明显活跃,红系明显升https://www.selleck.cn/products/ABT-263.html高,粒红比倒置,巨核细胞均增生活跃,未见明显病态造血;后期随访中有1例患者死于肝功能衰竭。4例患者血清菜油固醇、β-谷固醇的含量明显升高,其中3例可见豆固醇含量轻度升高。2、在PCR扩增及全外显子测序中,病例1发现了2个致病突变,即ABCG5基因中c.64C>T:p.Q22X及c.1336C>T:p.R446X的突变。病例2发现了3个致病突变,为ABCG8基因中c.A1732T:p.I578L、c.G1720A:p.G574R及c.T1621C:p.C541R突变。病例3发现了1个致病突变,为ABCG5基因中c.1336C>T:p.R446X:纯合无义突变。病例4发现了1个致病突变,为ABCG8基因c.323-2A>G纯合突变。经数据库检索ABCG8基因c.A1732T:p.I578L、c.T1621C:p.C541R突变及c.323-2A>G突变均为新发突变。第二部分:1、我们使用pc MINI和pc MINI-C两套载体,采用Minigene技术对病例4ABCG8基因c.323-2A>G突变进行转录后剪接方式的验证,结果发现c.322-2A>G突变会影响基因m RNA的正常剪接,且pc MINI和pc MINI-C两套载体的检测结果一致,都会导致Exon4跳跃,整个Exon4同时被剪切掉,蛋白翻译时将产生移码突变,在后续第10个氨基酸位置形成终止密码,其在c DNA及蛋白水平的表示方式为:c.323＿561delIACS-10759采购239bp p.Cys109Glyfs*10。2、在体外经Phage及GFP系列真核细胞表达载体中,ABCG8基因c.322-2A>G突变后导致HA-ABCG8-Flag及GFP-ABCG8 m RNA水平和融合蛋白水平表达量均显著下调。结论:1、本研究诊断的4例植物固醇血症患者,1例患者有典型的黄色瘤,2例患者伴有心血管累及,4例均有溶血性贫血及血小板减少;3例患者出现肝功能异常,外周血涂片可见巨大血小板、口形红细胞;骨髓细胞学均未见明显的病态造血等异常。4例患者血清植物固醇浓度(菜油固醇、β-谷固醇)均显著升高。2、通过基因测序,4例患者共发现了6个致病性突变,ABCG5、ABCG8均有,其中2个无义突变(ABCG5基因c.64C>T:p.Q22X和c.1336C>T:p.R446X突变),3个错义突变(ABCG5基因c.T1621C:p.C541R突变,ABCG8基因c.A1732T:p.I578L、c.G1720A:p.G574R突变),1个内含子突变(ABCG8基因c.323-2A>G突变)。其中经数据库检索,ABCG8基因c.A1732T:p.I578L、c.T1621C:p.C541R突变及c.323-2A>G突变均为新发突变。3、ABCG8基因c.323-2A>G纯合突变将导致ABCG8基因外显子4在转录后的剪接过程中被剪切掉(c.3Mendelian genetic etiology23＿561del239bp),在第5外显子中产生提前的终止密码子(p.Cys109Glyfs*10),最终导致疾病的发生。4、临床上对于出现黄色瘤、早发性冠心病、不明原因肝功能异常、溶血性贫血、口形红细胞、巨大血小板的患者应考虑植物固醇血症可能,需积极进行血清植物固醇浓度以及基因检测。

目的 基于癌症基因Laduviglusib NMR组图谱的多组学数据，探讨铜死亡相关基因在肺腺癌中的生物学特征及临床意义。方法 从2022年3月发表于Sselleckchem SCH772984cience杂志上的一篇研究中，获取铜死亡相关基因。利用癌症基因组图谱全基因组数据揭示铜死亡相关基因在肺腺癌中的突变谱及拷贝数变异景观，并分析其对转录组表达的影响。利用Metascape分析对铜死亡相关基因进行注释，以进一步了解这些基因参与的通路或功能。随后采用单因素Cox分析及Kaplan-Meier方法确定这些基因与肺腺癌患者预后的关系，并用CellMiner分析识别可能靶向铜死亡相关基因的潜在抗癌药物。结果 铜死亡相关基因在肺腺癌中的突变频率较低，而基因突变对转录组表达的影响可能取决于突变的类型。基因拷贝数变异是导致铜死亡相关基因表达紊乱的重要因素。16个铜死亡相关基因主要参与了乙醛酸代谢和甘氨酸Biogenic synthesis降解、铜离子进入、蛋白质脂酰化、细胞氨基酸分解代谢过程、氧化应激反应等，其中6个基因（DLD、FDX1、DLAT、DLST、PDHA1、CDKN2A）是肺腺癌患者的预后危险基因。CellMiner分析提示有13种药物与7个铜死亡相关基因存在相关性，他们可能是靶向铜死亡的潜在抗癌药物。结论 本研究首次揭示了铜死亡相关基因在肺腺癌中的生物学特征及临床意义，为后续开展铜死亡在癌症中的研究提供了一定参考与理论依据。

目的:本研究旨在探讨瑞香狼毒挥发油提取物中单体氧化石竹烯的药效学活性,以及它抑制肝癌细胞的作用机制,为氧化石竹烯抗肝癌的作用提供有力的理论支持。方法:1.第一部分:(1)瑞香狼毒挥发油成分的提取分离:将瑞香狼毒饮片粉碎,加热蒸馏提取挥发油。(2)挥发油组分成分分析;使用气相质谱联机检测分析,最后在化合物库中比对,分析出挥发油所含有的化学成分。2.第二部分体外细胞药效学实验:(1)通过CCK8实验检测氧化石竹烯对人肝癌细胞HCCLM3细胞、HUH7细胞和Hepg2细胞的活力的影响,筛选出氧化石竹烯作用48 h的有效剂量以及HUH7细胞和HCCLM3细胞进行后续的实验检测;(2)将HCCLM3细胞和HUH7细胞分组为对照组(Control)、氧化石竹烯低剂量组(COL组)、氧化石竹烯中剂量组(COM组)和氧化石竹烯高剂量组(COH组);(3)光学显微镜下观察HCCLM3细胞和HUH7细胞形态;(4)结晶紫染色观察氧化石竹烯对HCCLM3细胞和HUH7细胞存活情况的影响;(5)伤口愈合实验检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞迁移的影响;(6)Transwell ~(TM)实验检测氧化石竹烯对HCCLM3和HUH7细胞迁移的影响;(7)活性氧(ROS)染色检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞内活性氧水平的影响;(8)流式细胞术检测氧化石竹烯对HCCLM3和HUH7细胞凋亡的影响;(9)ABTS总抗氧化能力检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞内抗氧化能力的影响;(10)DPPH自由基清除率检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞内DPPH自由基清除能力的影响;(11)Iron Assay检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞内铁离子含量的影响;(12)Ferro Orange检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞内游离铁水平的影响;(13)Lipid peroxidation探针检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞内脂质过氧化水平的影响;(14)线粒体溶酶体共染色检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞内线粒体和溶酶体的影响;(15)基因沉默和过表达来检测氧化石竹烯对Protein Tyrosine Kinase抑制剂肝癌HCCLM3和HUH7细胞铁自噬的影响;(16)间接免疫荧光检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞铁自噬的影响;(17)Western blot检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞内蛋白质表达的影响;(18)荧光定量PCR检测氧化石竹烯对肝癌HCCLM3和HUH7细胞内相关基因表达的影响。3.体内动物药效学实验:(1)建立肝癌细胞HUH7裸鼠移植瘤动物模型;(2)分组:对照组(Control组)、顺铂组(Cisplatin,5 mg/kg)、索拉非尼组(Sorafenib,30 mg/kg)和氧化石竹烯三个剂量组(50、100、2c-Met抑制剂00 mg/kg);(3)记录裸鼠的体重、瘤重及抑瘤率;(4)微量还原型谷胱甘肽(GSH)测定、羟自由基抑制能力测定和丙二醛(MDA)测定裸鼠血清中的抗氧化物质表达情况;(5)铁离子含量测定检测裸鼠血清中铁离子的含量;(6)HE染色鉴定裸鼠的移植瘤组织病理学变化;(7)普鲁士蓝染色观察裸鼠移植瘤铁沉积情况;(8)通过免疫组织化学法检测氧化相关蛋白和铁自噬相关蛋白在移植瘤组织中的表达情况。结果:第一部分:(1)瑞香狼毒挥发油经提取分离后,发现主要化学成分为R-α-Pinene,α-Caryophyllene,Caryophyllene oxide,4-Methyl-1-(1-methylethyl)-3-cyclohexen-1-ol,D-Limonene;并发现氧化石竹烯(Caryophyllene oxide)对肝癌HUH7细胞具有显著的抑制作用,且存在剂量依赖性。第二部分:(1)氧化石竹烯能抑制肝癌HCCLM3和HUH7细胞的增殖、迁移,诱导肝癌HCCLM3和HUH7细胞凋亡。(2)氧化石竹烯能促进肝癌HCCLM3和HUH7细胞内的活性氧积聚,抑制肝癌HCCLM3和HUH7细胞的总抗氧化能力和DPPH自由基清除能力,抑制抗氧化蛋白Nrf2、HO-1、GPX4和NQO1的表达,引起细胞内的氧化应激。(3)氧化石竹烯能促进肝癌HCCLM3和HUH7细胞内铁离子含量升高,增强细胞内游离铁水平,从而促进肝癌HCCLM3和HUH7细胞内脂质过氧化水平升高,增加肝癌HCCLM3和HUH7细胞内溶酶体数量,促进自噬标志蛋白LC3Ⅱ的表达,从而促进细胞内自噬水平升高;同时,促进NCOA4蛋白表达和抑制FTH1蛋白的表达,促进细胞内铁自噬的发生。(4)氧化石竹烯能靶向调节肝癌HCCLM3和HUH7细胞内铁自噬相关蛋白的表达,促进si LC3Ⅱ和si NCOA4沉默后LC3Ⅱ和NCOA4蛋白的表达;抑制OEFTH1过表达后FTH1蛋白的表达;促进LC3Ⅱ和NCOA4的共定位,诱导细胞发生铁自噬,从而导致细胞死亡。第三部分:(1)氧化石竹烯可以显著抑制裸鼠移植瘤的生长,显著抑制HUH7荷瘤裸鼠肿瘤组织中KI67的表达,改善荷瘤裸鼠的生存状态,提高其生存质量。(2)氧化石竹烯可以显著抑制裸鼠血清中抗氧化物质GSH和羟自由基抑制能力,显著抑制裸鼠肿瘤组织中抗氧化蛋白Nrf2、HO-1、GPX4的表达,显著提高荷瘤裸鼠血清中的铁离子和丙二醛的含量,导致过度的脂质过氧化,引起体内氧化应激反应。(3)氧化石竹烯可以显著调控HUH7荷瘤裸鼠肿瘤组织中铁自噬蛋白NCOA4、LC3、FTH1的表达,显著促进HUH7荷瘤裸鼠肿瘤组织中铁沉积的发生,在肿瘤组织中引发铁自噬发生,诱导细胞死亡,从而抑制肿瘤组织生长。(4)氧化石竹烯可以导致裸鼠肿瘤组织发生病理形态改变,但不能使荷瘤裸鼠肝、心、脾、肺、肾内脏发生病理变化,证明其具有安全性。结论:在这项研究中,我们首先在瑞香狼毒挥发油中发现了氧化石竹烯,并通过使用发现氧化石竹烯能抑制两种肝癌HUH7和HCCLM3细胞的增殖,使细胞形态发生改变,抑制肿瘤组织的生长,并且影响细胞的迁移,增加了细胞的凋亡和死亡。在机制上,我们还进一步发现氧化石竹烯以剂量依赖性的方式促进Hendobronchial ultrasound biopsyCCLM3和HUH7细胞内ROS积聚,抑制细胞内自由基的清除,抑制抗氧化物质和抗氧化蛋白的表达,能增加细胞内Fe~(2+)的含量,致使细胞内发生脂质过氧化,增加肿瘤组织中的铁沉积,促进MDA脂质过氧化发生,致使细胞发生铁自噬,最终导致肝癌细胞的死亡。