骨关节炎(osteoarthritis,OA)是全球目前最常见的骨关节慢性致残性疾病,现有的OA管理策略主要集中在改善症状和功能,终末期患者不得不进行关节置换手术治疗。因此,迫切需求一种能延缓OA进展的治疗方法。低氧应答机制在人体多种组织、器官以及病变中发挥重要的作用。正常关节软骨缺乏血液供应,其吸收的营养物质主要从关节液中获取。相对血液及氧供丰富的骨组织,关节软骨是一个低氧组织,氧气HIV-1 infection含量大概在1%-10%,且从表层软骨到深层的钙化软骨层逐渐降低。低氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)是低氧环境下细胞应对低氧反应的关键调节因子,目前研究多集中在HIF 1α和HIF 2α对软骨退变的影响。既往研究发现,正常生理条件下软骨细胞可通过激活HIF 1α途径,刺激多种与软骨基质合成和转运相关基因,如Col II、ACAN和SOX9的表达,从而达到维持关节软骨基质合成与分解以及能量代谢稳定的目的。由此可见,HIF 1α是帮助关节软骨适应低氧环境的主要因子。在OA病程中,HIF 2α途径被激活,多种调控软骨基质分解和炎症反应的基因,软骨细胞合成与分解及能量代谢的调控失衡,从而导致关节软骨退变。目前在基础研究领域,OA进展中软骨细胞对于低氧的反应还是集中在HIF家族。在OA发生发展过程中,软骨细胞是否存在其他的低氧应答调控机制,对于进一步描绘低氧环境下OA的调控网络有着重要的意义。NDRG3是N-myc下游调节基因(N-myc downstream regulated gene,NDRG)家族成员之一,在生物体内参与到细胞增殖和分化等多个生物学调控过程。相关研究证实NDRG3在肿瘤细胞增殖、血管内皮细胞更新、细胞减数分裂DNA损伤修复过程中起到关键的调控作用。最新研究证据表明,NDRG3能够独立调控肿瘤细胞的低氧应答,提示我们,细胞对低氧应答的信号通路可能不仅仅局限在HIF家族。在OA病理进展中,除了已知的经典HIF家族,NDRG3可能也参与了其中,独立调控软骨细胞对低氧的适应性。因此,本研究在确证NDRG3在关节软骨组织表达的前提下,首先分析低氧环境下,软骨细胞NDRG3、HIF 1α和HIF 2α的表达模式;然后通过构建NDRG3敲低或过表达慢病毒载体,探讨低氧环境下NDRG3对软骨细胞及小鼠膝关节OA的影响;同时结合代谢组学及转录组学数据,分析NDRG3可能涉及的分子通路,然后进行验证;最后针对NDRG3靶点,有目的性的设计可以缓释低氧环境下脂肪间充质干细胞来源外泌体(HExos)的热响应型水凝胶,验证其通过影响NDRG3的表达来维持软骨细胞的功能,为临床真正延缓OA进展提供新的理论基础及依据。因此,本论文的主要工作如下:1.NDRG3对软骨细胞及小鼠膝关节OA病理进展的作用研究本部分内容主要研究了人OA软骨组织中NDRG3、HIF 1α、HIF 2α的表达情况,NDRG3、HIF 1α、HIF 2α在低氧环境下的表达模式,NDRG3对软骨细胞合成及分解代谢的影响,以及NDRG3对延缓小鼠膝关节OA进展的作用。研究结果显示:⑴人OA软骨组织中,NDRG3的表达和OARSI分级成正相关;⑵在低氧环境下,软骨细胞NDRG3的表达随着缺氧时间的延长,表达逐渐增加,最后趋于稳定;⑶在成功构建的敲低或过表达NDRG3ATDC5软骨细胞系中,发现NDRG3表达增加可以促进软骨细胞的合成代谢,抑制其分解代谢;⑷小鼠膝关节ACLT OA模型中,注射NDRG3过表达慢病毒载体,通过使软骨细胞NDRG3表达增加,促进软骨细胞的合成代谢,抑制其分解代谢,从而延缓小鼠膝关节OA进展。2.NDRG3对软骨细胞及小鼠膝关节OA病理进展的机制研究本部分内容主要基于代谢组学和转录组学的联合分析结果,提示PI3K-AKT-mTOR信号通路可能是NDRG3促进软骨细胞合成代谢,抑制其分解代谢,同时延缓小寻找更多鼠膝关节OA进展的主要信号通路。在成功构建的敲低或过表达NDRG3 ATDC5软骨细胞系中,发现软骨细胞低表达NDRG3,其自噬、增殖能力减弱,凋亡增加;软骨细胞过表达NDRG3,其自噬、增殖能力增强,凋亡减弱,这是通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路中PI3K及AKT磷酸化来实现的。3.具有缓释外泌体功能的热响应型水凝胶靶向调控NDRG3的OA治疗研究在HExos促进NDRG3表达来维持软骨细胞稳态的基础上,成功构建的HA-Pluronic热响应型水凝胶在体外可以持续释放外泌体,释放曲线显示可达12天的缓释。负载外泌体的HA-Pluronic热响应型水凝胶通过促进NDRG3的表达,能降低低氧条件下IL-1β诱导的软骨细胞凋亡,同时抵抗IL-1β诱导的软骨细胞增殖抑制,促进软骨细胞基质合成蛋白Col II和SOX9的表达,降低MMCompound C供应商P-13的表达,有利于维持软骨细胞稳态及延缓小鼠膝关节OA进展。