研究背景呼吸道病毒感染是引起儿童急性呼吸道感染最常见的原因。人腺病毒是引起全球5岁以下儿童急性呼吸道感染的重要病原体,其中HAdV-3和HAdV-7是最常见的基因型。与HAdV-3相比,HAdV-7感染患者的病毒血症发生率更高,且与重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征、多脏器功能衰竭的发生有关。这表tissue blot-immunoassay明病毒血症与疾病的严重程度和死亡直接相关。因此,研究HAdV-7引起病毒血症的分子机制,对限制病毒的全身性扩散和多器官功能衰竭具有重要的意义。肺泡-毛细血管屏障在抵御病原体入侵中发挥重要作用。因屏障的极性导致子代病毒释放具有方向性。病毒顶端释放倾向于引起局部感染,而基底端或双向释放更容易引起病毒血症,进而感染其他脏器。我们前期研究发现HAdV-7和HAdV-3感染肺泡上皮细胞后,新形成的子代病毒从肺泡上皮细胞的顶端释放,表明HAdV-7可能是通过其他途径穿过屏障进入血液系统,引起病毒血症。肺泡上皮细胞间连接结构维持着屏障功能的完整性。细胞间紧密连接损伤导致屏障功能破坏和通透性增加,促进传染性病原体、外源性毒素和内源性产物进入血液系统,从而引起多器官功能衰竭。因此,HAdV-7和HAdV-3感染肺泡上皮细胞破坏紧密连接的差异可能是HAdV-7感染更易引起病毒血症的原因之一。研究目的比较HAdV-7和HAdV-3感染极化肺泡上皮细胞后的感染率、复制能力、屏障功能完整性、细胞间紧密连接蛋白的差异,阐明HAdV-7感染更易引起病毒血症的机制。研究方法1、用I型鼠尾胶原(12.12μg/孔)包被transwell上室,将肺泡上皮细胞(5×104/孔)接种于上室,构建极化肺泡上皮细胞模型。培养第三天,加入地塞米松(1μM/孔),每天换液并测定TEER和下室FITC-葡聚糖荧光强度。2、用10TCID50/cell的HAdV-3、HAdV-7分别感染极化肺泡上皮细胞,通过间接免疫荧光检测第0、1、2、3天病毒Hexon蛋白的表达,使用Image-J计算第1、2、3天不同感染组肺泡上皮细胞感染率(细胞感染率=Hexon阳性细胞数/DAPI染色下细胞总数× 100%);收集第0、1、2、3天感染上清通过50%组织细胞感染量(TCID50)测定病毒滴度。3、实验分为病毒组(HAdV-3、HAdV-7)、灭活病毒组(56℃水浴30min灭活的HAdV-3、HAdV-7)和阴性对照组(1640基础培养基),10TCID50/cell的HAdV-3、HAdV-7和灭活的HAdV-3、HAdV-7selleckchem Smoothened Agonist分别感染极化肺泡上皮细胞屏障,测定每组感染后第0、1、2、3天的跨膜电阻(TEER)和FITC-葡聚糖的荧光强度,比较不同感染组屏障的完整性及通透性。4、实验分为病毒组(10TCID50/cell的HAdV-0、HAdV-7)和阴性对照组(1640基础培养基),通过间接免疫荧光检测感染后第0、1、2、3天claudin 4、occludin、JAM-A蛋白的表达,通过Image-J计算各个蛋白的平均荧光强度(平均荧光强度=该视野荧光强度总和/该视野面积),比较不同感染组紧密连接蛋白的变化情况。5、采用GraphPadNSC125066 Prism 6.01软件对数据进行统计分析,变量结果采用均数±标准差(x±SD)表示,多个组(≥3)间比较差异采用多因素方差分析,两个组间比较差异采用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1、HAdV-7、HAdV-3感染极化肺泡上皮细胞后均可检测到病毒Hexon蛋白的表达,表明两种病毒均能感染肺泡上皮细胞;HAdV-7感染后第1、2、3天的细胞感染率高于HAdV-3感染,其中第3天的感染率(3.62±0.51)%显著高于HAdV-3(1.97±0.15)%(P<0.05);HAdV-7 感染后第 1 天(1×102.42±0.07TCID50/ml)、第2 天(1×104.00±0.25TCID50/ml)、第 3 天(1×10 4.33±0.14TCID50/ml)上清的病毒滴度显著高于 HAdV-3 感染后第 1 天(1×101.92±0.14TCID50/ml)、第 2 天(1×103.33±0.14TCID50/ml)、第 3 天(1×103.92±0.14TCID50/ml)(P<0.05)。2、灭活的HAdV-3、HAdV-7感染极化肺泡上皮细胞后TEER下降程度与下室FITC-葡聚糖的荧光强度与阴性对照组未见明显差异。HAdV-7感染后第1天TEER 下降程度为(16.10±0.52)%、第 2 天为(50.83±1.53)%、第 3 天为(72.85±0.35)%,其中第1、2、3天下降程度均显著高于阴性对照组(P<0.01);HAdV-3感染后第1天TEER下降程度为(14.18±0.53)%、第2天为(34.40±1.24)%,第3天为(60.98±0.73)%,其中第2、3天下降程度显著高于阴性对照组(P<0.01);HAdV-7感染后第2、3天TEER的下降程度显著高于HAdV-3感染(P<0.01)。HAdV-7感染后下室FITC-葡聚糖的荧光强度在第2天(1949.67±52.91)、第3天(3145.33±25.30)显著高于阴性对照组(P<0.01);HAdV-3感染后下室FITC-葡聚糖的荧光强度在第2天(1716.17±36.94)、第3天(1940.00±23.19)天显著高于阴性对照组(P<0.01);HAdV-7感染后第2、3天FITC-葡聚糖的荧光强度显著高于HAdV-3感染(P<0.01),表明HAdV-7感染能引起更严重的屏障损伤。3、HAdV-7和HAdV-3感染极化肺泡上皮细胞后第2、3天claudin 4、JAM-A、occludin蛋白的平均荧光强度与阴性对照组相比均降低(P<0.05)。HAdV-7感染后第2、3天claudin 4的平均荧光强度显著低于JAM-A、occludin(P<0.05),而HAdV-3感染后第2、3天claudin 4的平均荧光强度与JAM-A、occludin相比未见明显差异。表明HAdV-7感染肺泡上皮细胞后紧密连接蛋白中以claudin 4受损为主。研究结论HAdV-7感染极化肺泡上皮细胞后感染率及复制能力均高于HAdV-3,并且引起肺泡上皮细胞屏障更严重的损伤,HAdV-7感染极化肺泡上皮细胞后紧密连接蛋白claudin 4、JAM-A、occludin表达降低,尤其是claudin 4。claudin 4蛋白可能在HAdV-7感染引起病毒血症中起关键作用。