由禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)引起的大肠杆菌病是一种严重威胁养禽业发展的细菌性疾病。酪氨酸磷酸化在细菌中广泛存在,其中酪氨酸激酶和磷酸酶作为酪氨酸磷酸化系统主要组成部分,参与细菌生命活动和致病过程。目前,在大肠杆菌中发现Etk和Etp与Wzc和Wzb这两组酪氨酸激酶及其磷酸酶,参与调控细菌荚膜多糖和胞外多糖合成,但它们是否参与调节其他生物学功能和致病作用尚不清楚,与宿主细胞的感染机制也未解答。基于此,本研究拟从这两组细菌酪氨酸激酶和磷酸酶入手,开展其对禽致病性大肠杆菌致病调控机制的研究。首先,分别构建激酶和磷酸酶缺失株和回补株,分析该基因对APEC生物学功能和致病性的影响,比较这两组酪氨酸激酶和磷酸酶对APEC致病作用的贡献度;构建激酶Etk和Wzc的酪氨酸突变菌株,模拟去磷酸化和持续磷酸化状态,寻找关键磷酸化位点;进一步基于iTRAQ定量蛋白质组学,比较酪氨酸激酶Etk和Wzc对APEC胞外蛋白的影响,分析差异蛋白和信号通路,筛选其潜在底物蛋白;最后,通过鸡气管黏膜上皮细胞感染模型,分析激酶Etk和Wzc对宿主细胞的损伤作用,利用细胞转录组学分析APEC感染鸡气管黏膜上皮细胞的差异基因和信号通路,探究激酶对NF-κB信号通路的磷酸化情况,为深入解析细菌酪氨酸激酶和磷酸酶功能及其调控机制奠定重要基础,为防治禽大肠杆菌病和筛选新型抗菌药物提供新方向。本文主要研究内容与结果如下:1.酪氨酸激酶Etk和磷酸酶Etp对禽致病性大肠杆菌致病作用研究成功构建酪氨酸激酶etk和磷酸酶etp缺失株和回补株,与野生株AE81相比,缺失etk和etp后显著降低AE81的运动性(P<0.01)、生物被膜形成(P<0.001)、抵抗血清杀菌和环境耐受等能力;电镜观察缺失株的鞭毛数量和长度减少,菌体之间粘连物质减少,在介质表面仅形成单层生物被膜。缺失株Δetk和Δetp中鞭毛flg B、flg E、flg M、fli C和fli H和生物被膜csg D、mcb R、mlr A、fim H和fim A的转录水平均不同程度降低。与野生株AE81相比,缺失株Δetk和Δetp对DF-1细胞的黏附能力减弱(P<0.01),抗HD11细胞的吞噬作用显著减弱(P<0.001),在雏鸡体内的致病力减弱,在心、肝、脾和肺组织中载medical textile菌量显著下降。通过生物信息学预测激酶Etk磷酸化位点,构建12个酪氨酸位点的点突变株,其中Y56和Y574位点影响APEC生物学功能。通过解析激酶Etk和磷酸酶Etp对APEC生物学功能和致病性的作用,表明Etk和Etp正调控APEC致病过程。2.酪氨酸激酶Wzc和磷酸酶Wzb对禽致病性大肠杆菌致病作用研究本研究同时构建激酶wzc和磷酸酶wzb缺失株和回补株,比较两组激酶和磷酸酶对APEC致病作用的贡献度。与野生株AE81相比,缺失wzc显著降低AE81生物被膜形成能力(P<0.001),降低在高渗条件下存活能力(P<0.05),增强在酸性和过氧化氢环境中的存活能力(P<0.01);缺失wzb降低AE81运动性(P<0.05),增强在不同环境条件下存活能力;缺失株Δwzc和Δwzb降低抗血清杀菌能力,减弱对DF-1细胞的黏附和抗HD11细胞吞噬能力。Δwzc在雏鸡的心、肝、脾和肺组织中定植能力增强,Δwzb在心、肝、脾和肺组织中定植能力减弱。构建10个激酶Wzc酪氨酸磷酸化位点突变株,其中,Y205、Y569、Y705和Y710这四个酪氨酸位点影响APEC生物学特性。基于上述两个研究内容,系统性解析两组激酶及其磷酸酶对APEC致病调控作用,表明酪氨酸磷酸化广泛参与APEC致病过程。3.基于iTRAQ蛋白质组分析APEC激酶Etk和Wzc的胞外蛋白谱本研究基于iTRAQ定量分析APEC胞外分泌的差异表达蛋白,结果显示,缺失株Δetk共定量1370个差异蛋白,其中363个蛋白上调,1007个蛋白下调;通过GO和KEGG富集分析,差异蛋白主要富集次生代谢物的生物合成、抗生素的生物合成、碳代谢、ABC转运、核糖体、双组分系统和群体感应等通路。缺失株Δwzc蛋白质组共定量493个差异蛋白,其中237个蛋白上调,256个蛋白下调,差异蛋白主要富集不同环境下的微生物代谢、双组分系统、核糖体、鞭毛组装、氧化磷酸化、生物膜形成-大肠杆菌、细菌趋化性和细菌分泌系统等通路。选择显著差异且与上述表型相关的鞭毛蛋白(flg D、fli C和flg M)、反应调节因子omp R、分泌系统蛋白(esp Y、sec G和sec D)和热休克蛋白dna K进行荧光定量PCR检测,其上下调趋势与蛋白质组学的结果一致Ferrostatin-1细胞培养。本研究基于蛋白质组学发现细菌蛋白激酶Etk和Wzc影响细菌代谢和毒力蛋白的表达,为后续激酶底物蛋白的验证提供潜在靶标。4.激酶Etk和Wzc对鸡气管黏膜上皮细胞的致病作用研究通过鸡气管黏膜上皮细胞感染模型,探究酪氨酸激酶Etk和Wzc对宿主细胞的损伤作用。与野生株AE81相比,缺失酪氨酸激酶和磷酸酶基因后减弱对CTECs细胞的毒性作用(P<0.05);缺失株Δetk感染CTECs细胞后,宿主差异表达基因总计191个,其中显著上调基因168个,下调基因23个。差异基因主要富集IL-17信号通路、细胞因子与细胞因子受体的相互作用、TNF信号通路、Toll样受体信号通路和NF-κB信号通路等。缺失株Δwzc感染CTECs细胞后,宿主差异表达基VX-765溶解度因总计386个,其中显著上调263个,下调123个。差异基因主要富集在核糖体、氧化磷酸化、RNA降解和硫胺素代谢等信号通路。缺失wzc后主要引起细胞物质合成和代谢相关通路变化,缺失etk后影响细胞免疫炎症信号通路变化,表明,二者在细胞生物学过程中扮演不同的角色。通过流式细胞术、Annexin V-FITC/PI双染和WB检测,发现与野生株AE81相比,缺失激酶etk和wzc后,CTECs细胞凋亡能力减弱,Caspase-3表达量下降。缺失株Δetk增强p65蛋白的磷酸化(P<0.01),Δwzc抑制IκBα和p65蛋白磷酸化(P<0.01)。表明,激酶Etk和Wzc积极参与对宿主细胞的致病作用。综上所述,本研究以禽致病性大肠杆菌酪氨酸激酶和磷酸酶为研究对象,全面解析其对APEC生物学功能和致病性的影响,发现其通过影响细菌鞭毛、生物被膜、环境耐受、抵抗血清杀菌、细胞黏附和抗吞噬等过程,参与调控APEC致病过程,并筛选得到一些酪氨酸磷酸化位点和潜在的底物蛋白;蛋白激酶Etk和Wzc可引起鸡气管黏膜上皮细胞损伤、凋亡等,并参与NF-κB信号通路磷酸化过程,为后续禽致病性大肠杆菌致病机制研究和相关药物靶标研发提供新方向。