一.研究背景结直肠癌(CRC)是世界第三大恶性肿瘤,全球结直肠癌的发病率和死亡率仍持续升高,目前,其发病率和死亡率已攀升到第三位和第二位,而结直肠癌淋巴结转移是死亡率升高的主要原因。目前临床上在诊断CRC淋巴结转移方面,影像学(CT、MRI、PET-CT)仍是首选,但其诊断准确率不高。所以CRC临床治疗指南建议不管CRC有无合并淋巴结转移,手术过程中均需要进行淋巴结清扫。而淋巴结清扫会出现如肠粘连、肠梗阻、淋巴管漏、腹膜炎等严重并发症,因此,对无淋巴结转移的CRC患者将出现过渡治疗。DNA甲基化作为表观遗传学一种主要修饰,已证实它与肿瘤的发生发展密切相关。本课题研究旨在通过术前得到的CRC肿瘤组织,在分子水平层面上,用发现的DNA甲基化位点来鉴别CRC淋巴结转移状态,以更精确的服务CRC的临床诊疗。二.研究方法首先,对30例CRC新鲜冰冻组织进行提取DNA,通过转化后,进行全基因组甲基化测序。通过差异性分析筛选出区分CRC淋巴结转移的甲基化位点;其次,根据筛选出的DNA甲基化位点设计出该位点匹配的引物及探针,利用Methylight实时定量PCR对221例CRC(118例淋巴结阴性患者和103例淋巴结阳性患者)样本进行验证;再次,筛选出的DNA甲基化位点在鉴别淋巴结转移效能上与临床上的影像学、胃肠道相关肿瘤抗原(CA19Fecal immunochemical test9)、血清癌胚抗原(CEA)以及临床病理指标进行对比;最后,根据筛选出的位点设计相对应抗体,使用免疫组化技术,在随机选出56例CRC(28例淋巴结阴性患者和28例淋巴结阳性患者)组织切片上,验证其在CRC淋巴结转移上的检验效能。三.实验结果根据差异甲基化区域(DMR)分析,总共筛选出3个具有DMR的最佳甲基化位点分别是LBX2,STMN3,SS18L1,3个位点在221个CRC样本验证中,筛选出最佳的DNA甲Bafilomycin A1基化位点LBX2,其特异性为0.87,敏感性为0.76,准确性为 0.82,曲线下面积(AUC)为 0.87(95%CI 0.82-0.92,P<0.0001);相比之下,影像学的 AUC 为 0.52(95%CI,0.45-0.59);CA199 的 AUC 为 0.58(95%CI 0.51-0.66);CEA 的 AUC 为 0.56(95%CI0.48-0.64),浸润深度的 AUC 为 0.61(95%CI0.54-0.67,P<0.01),淋巴管浸润的 AUC 为 0.63(95%CI 0.57-0.69,P<0.001),LBX2诊断效能优于目前临床传统的诊断手段。同时,LBX2抗体在免疫组化验证中,其AUC为0.84(95%CI 0.77-0.90,NirogacestatP<0.001),说明LBX2在蛋白水平同样可以区分CRC淋巴结转移。四.结论实验证明,相比于传统的诊断CRC淋巴结转移的方法,DNA甲基化位点LBX2可以作为更为可靠的诊断方法,其有望成为CRC精准手术的治疗依据和预后评估的指标。