四氢嘧啶是一种高附加值的Taurine试剂保湿剂和保护剂,广泛应用于医药、化妆品等领域,可由一些中度嗜盐菌天然合成,也可采用大肠杆菌异源合成,但异源合成途径酶反应常常面临中间代谢物快速扩散和底物利用效率低等问题。本研究利用DNA支架系统在大肠杆菌中将四氢嘧啶合成途径关键酶进行定位组装,促进中间代谢物在不同酶之间高效递送,从而提高四氢嘧啶合成途径的转化率和产物得率。具体研究结果如下:(1)四氢嘧啶生物合成途径酶与ZF结构域融合表达质粒构建。以p FT24作为起始质粒,采用温敏回路开关c I~(ts)-p _R-p _L来控制四氢嘧啶合成基因簇ect ABC的表达,得到重组质粒p FT24-ect ABC;进一步利用G4S linker序列将参与四氢嘧啶合成途径的酶(Ect A、Ect B和Ect C)与对应的ZF结构域(ZFa、ZFb和ZFc)融合表达,得到重组质粒p FT24-ect ABC-ZFabc;并将前体供purine biosynthesis给途径中Eclys C*、asp DH、ppc三个基因连接到质粒p FT24-ect ABC-ZFabc上进行过表达,得到重组质粒p FV1,对应菌株MWZ003/p FV1产量为1.26 g·L~(-1)。(2)替换重组质粒复制子调节大肠杆菌中四氢嘧啶合成关键酶表达量。将质粒p FV1的p15A复制子分别用Col A、RSF1030和p MB1复制子替换,得到新的重组质粒p FV2、p FV3和p FV4。摇瓶发酵结果表明拥有最高拷贝数p MB1复制子更适合于四氢嘧啶的生产,其对应菌株MWZ003/p FV4产量达到11.85 g·L~(-1),相比于MWZ003/p FV1提高了8.4倍。(3)设计和优化DNA支架定位组装四氢嘧啶合成途径酶进行级联反应。在重组质粒p FV4基础上插入DNA支架结构,用于精准固定ZF融合酶。通过调整DNA支架上酶结合位点间距和酶结合方向,优化DNA支架重复单元,并改变DNA支架上酶结合位点的化学计量数,其中酶反向结合、11 bp间距、4个重复单元且1:1:2化学计量比的菌株MWZ003/p FV20的四氢嘧啶转化效率最佳,其产量达到17.97 g·L~(-1),相比于不含有DNA支架对照菌株MWZ003/p FV4提高了51.65%。(4)增加菌株细胞内限速酶Ect B的表达量并优化发酵变温条件。在质粒p FV4的Ect B-ZFb融合酶表达基因之前插入P_R启动子,获得重组质粒p FV24。在重组质粒p FV24基础上插入DNA支架结构,进一步探究增加限速酶Ect B的表达量后DNA支架最适酶结合位点化学计量数,研究发现酶反向结合、11 bp间距、4个重复单元且寻找更多1:2:2化学计量比的菌株MWZ003/p FV30的四氢嘧啶转化效率最佳,其产量达到19.95 g·L~(-1)。本研究采用温度控制开关来转换菌株生长和生产模式,通过设置三个不同的温度转换时间(3 h、4 h和5 h),得到菌株MWZ003/p FV30在发酵开始后4 h将温度由37℃转换为42℃的四氢嘧啶产量达到22.79 g·L~(-1),相比于初始菌株MWZ003/p FV4提升了接近1.92倍,且产物转化率为0.65 g·g~(-1)葡萄糖。