研究目的:急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是较为常见的一种炎症性疾病,近年来发病率逐年上升。主要的病理表现是水肿,腺GDC-0973体外泡细胞坏死,炎症细胞浸润和出血。临床上多为轻症,但少数也会进展为重症急性胰腺炎,死亡率较高。目前急性胰腺炎的发病机制尚未阐明,故治疗多采取对症用药。免疫反应是急性胰腺炎发生发展过程中较为重要的一环,而细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(Cytotoxic T Lymphocyte antigen 4,CTLA-4)是T细胞表面常见的免疫检查点。我们想要探究CTLA-4在急性胰腺炎中的表达水平变化情况及相关作用机制,从而探究其作为潜在治疗靶点的可能性,为急性胰腺炎的治疗提供新的思路。研究方法:第一部分:选择32只C57BL/6J小鼠随机分为生理盐水对照(Control)组、急性胰腺炎6小时(AP-6h)组、急性胰腺炎12小时(AP-12h)组和急性胰腺炎18小时(AP-18h)组,每组8只。通过逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠法,建立BYL719 molecular weight急性胰腺炎小鼠模型。在AP-6h、AP-12h和AP-18h组中,逆行胰胆管注射10μL/10 g体重的2.5%牛磺胆酸钠溶液;Control组腹腔注射等体积的生理盐水。在造模后指定时间点麻醉sociology of mandatory medical insurance小鼠,摘取眼球取血分离血清,分离出胰腺和脾脏。使用动物全自动生化分析仪来检测血清淀粉酶、脂肪酶的含量;把胰腺组织制备成石蜡切片,进行HE染色和组织病理学评分;采取免疫组化染色来技术检测胰腺组织中CTLA-4和MPO的表达;采用qRT-PCR技术检测胰腺组织中CTLA-4和GAPDH的mRNA表达水平;通过流式细胞术检测脾脏中CD3~+T细胞上CTLA-4的表达水平。第二部分:选择24只C57BL/6J小鼠随机分为生理盐水对照(Control)组、造模(AP)组和伊匹单抗(Anti-CTLA-4)组,每组8只。Anti-CTLA-4组的小鼠,在造模前的12小时注射200μg的伊匹单抗溶液,其余两组注射等体积的生理盐水。在AP组和Anti-CTLA-4组中,逆行胰胆管注射10μL/10 g体重的2.5%牛磺胆酸钠溶液;Control组注射等体积的生理盐水。在造模后指定时间点麻醉小鼠,摘取眼球取血分离血清,分离出胰腺和脾脏。使用动物全自动生化分析仪检测血清淀粉酶、脂肪酶的水平;将胰腺组织和肺组织制备成石蜡切片,进行HE染色和组织病理学评分;通过免疫组化染色技术检测胰腺组织中CTLA-4和MPO的表达;采用qRT-PCR技术来检测胰腺组织中CTLA-4、IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α、CD80和CD86的mRNA表达水平;使用流式细胞术检测脾脏CD3~+T细胞上CTLA-4的表达;采用酶联免疫吸附实验检测小鼠血清中的IL-6、IL-10的含量;采取免疫荧光技术来检测胰腺组织免疫细胞膜表面CD80和CD86的定位和表达。研究结果:一、CTLA-4在急性胰腺炎小鼠模型中高表达1、逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠成功构建急性胰腺炎小鼠模型(1)急性胰腺炎组小鼠在造模后躯干蜷缩,肢体偶尔抽搐,进食饮水较少。HE染色表明,与对照组相比,AP-6h、AP-12h、AP-18h组的胰腺组织中可以看到典型的病理炎症表现(如水肿,间隙增宽,炎症细胞浸润)。(2)胰腺组织病理学评分结果说明,AP-6h、AP-12h、AP-18h组的病理评分均与对照组的增高(P<0.05)。(3)AP-6h、AP-12h、AP-18h组的血清淀粉酶、脂肪酶含量与对照组相比均增加(P<0.05)。(4)MPO的免疫组化结果表明,与对照组相比,AP-6h、AP-12h、AP-18h组胰腺组织中MPO高表达,说明中性粒细胞浸润程度增加。2、CTLA-4在急性胰腺炎小鼠模型中高表达(1)qRT-PCR实验结果表明,急性胰腺炎小鼠胰腺组织中CTLA-4的mRNA水平明显高于对照组(P<0.05)。(2)流式细胞术实验结果表明,AP-6h、AP-12h和AP-18h组,与对照组相比,脾脏中CD3~+CTLA-4~+T细胞的比例均增加。(3)通过免疫组化实验发现与对照组相比,CTLA-4在急性胰腺炎小鼠的胰腺组织及脾脏免疫细胞中高表达。二、抑制CTLA-4的表达,加重胰腺损伤并提高炎症因子水平及其机制1、抑制CTLA-4的表达,加重胰腺损伤并提高炎症因子水平(1)小鼠胰腺组织切片进行HE染色并进行病理学评分,可以发现注射伊匹单抗造模小鼠在造模12h后,与正常造模组小鼠相比,胰腺组织的炎症病理表现明显加重(P<0.05)。(2)小鼠胰腺组织MPO免疫组化染色结果表明,,可以发现注射伊匹单抗造模小鼠在造模12h后,与正常造模组小鼠相比,胰腺组织的炎症细胞浸润增加(P<0.05)。(3)小鼠血清淀粉酶和脂肪酶检测,结果表明与AP组相比,Anti-CTLA-4组血清脂肪酶水平均升高(P<0.05)。(4)小鼠肺组织病理评分结果说明,Anti-CTLA-4组急性肺损伤病理比AP组明显加重(P<0.05)。(5)小鼠胰腺组织qRT-PCR实验结果表明,与AP组相比,Anti-CTL-4组小鼠胰腺组织中IL-6、IL-10和IL-1βmRNA表达水平升高(P<0.05)。(6)Elisa检测各组小鼠血清炎症因子的水平,结果表明,Anti-CTLA-4组小鼠血清中的IL-6、IL-10水平比AP组升高(P<0.05)。2、CTLA-4可能通过与CD86结合发挥调控作用(1)qRT-PCR和免疫荧光的实验结果表明,CD80 mRNA和蛋白的表达在Control组、AP组和Anti-CTLA-4组中无明显差异。(2)CD86的qRT-PCR结果表明,与对照组相比,AP组小鼠胰腺组织中CD86mRNA表达水平明显增加(P<0.05);与AP组相比,注射伊匹单抗的Anti-CTLA-4组小鼠胰腺组织中CD86 mRNA的表达水平降低(P<0.05)。(3)免疫荧光结果表明,AP组小鼠胰腺组织中免疫细胞膜表面有CD86表达,而Anti-CTLA-4组小鼠胰腺组织中细胞膜表面几乎无CD86表达。研究结论:一、CTLA-4在急性胰腺炎小鼠模型中高表达。二、抑制CTLA-4的表达可加重胰腺损伤和提高炎症因子水平,其可能通过与CD86结合调节炎症反应,从而对小鼠急性胰腺炎起到保护作用。