研究背景:糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)最为凶险的并发症之一,现已成为引起慢性肾脏病(CKD)的主要病因之一,迄今DN仍缺乏有效的治疗手段,其发病机制以及治疗方法一直是国内外学者探索的热点。足细胞脱落和凋亡、存活的足细胞代偿性肥大和足突融合是DN早期最主要的病理变化之一,足细胞的损伤诱发蛋白尿可导致DN持续进展。由于足细胞具有有限的修复和再生能力,其损伤的程度是决定DN预后的重要因素,因此进一步探讨DN足细胞损伤的分子机制及防治策略具有重要意义。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类新兴的非编码RNA(ncRNA)家族成员,它在真核生物体内普遍存在,且其不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴,通过外显子或内含子的反向剪接并以共价键形成环形结构。circRNA的闭合环状结构使其不易被降解核苷酸的核酸外切酶所降解,因此比线性RNA更加稳定。它有一定的序列保守性,主要位于细胞质或储存于外泌体中,在转录或转录后水平发挥调控作用。circRNA具有多种生物学特性,包括micro RNA(miRNA)海绵效应或ce RNA的作用,亲代基因调控,RNA-蛋白质相互作用(RBP),蛋白质复合体支架、也有少数circRNA具有翻译功能。近年来,越来越多的证据表明circRNA在各种疾病(包括肿瘤,神经系统疾病,血液系统疾病,心血管系统疾病等)的进展中起着至关重要的调节作用,而在肾脏疾病发病机制中的作用尚待阐明。新近研究发现circ HLA-C通过海绵吸附miR-150在狼疮性肾炎中的扮演重要角色,circ Nr1h4通过靶向miR-155-5p调节高血压肾病的发病进程,在肾癌患者中,circRNAZNF609通过绑定miR-138-5p影响FOXP4的表达。在DN小鼠中,circ LRP6表达显著上升且在高糖条件下靶向作用于miR-205进而介导系膜细胞损伤。此外,Circ＿WBSCR17通过miR-185-5p/SOX6轴向调控高糖诱导的肾小管上皮细胞(HK-2)的功能障碍。那么在DN足细胞损伤过程中,circRNA是否也可以通过“circRNA–miRNA–m RNA”轴发挥作用引起了我们的关注。近年权威研究发现circRNAs有更丰富的N6-甲基腺苷(m6A)修饰,从生成机制上看,circRNA的m6A修饰主要由m6A修饰酶METTL3和METTL14添加并被去修饰酶FTO和ALKBH5可逆性的去除。m6A修饰在维持circRNA生物学活性上具有重要的功能。m6A修饰除了具有调节circRNA稳定性的经典功能之外,还可以通过调控circRNA与miRNA互作来影响circRNA的miRNA海绵效应。然而在DN中,m6A修饰是否调控circRNA表达仍待探讨。课题组前期研究发现足细胞METTL3介导的m6A甲基化调控DN的进展。因而,本研究将深入探究circ-0000953调控DN足细胞损伤以及m6A甲基酶METTL3调控circ-0000953的表达水平的作用和机制,有助于为DN防治提供新理论和药物新靶点。方法:第一部分:STZ腹腔注射构建1型糖尿病小鼠模型,运用全转录组高通量测序筛选肾脏差异性变化的circRNA。采用Real-time PCR(RT-PCR)验证小鼠肾脏circRNA变化水平。接着我们在体外高糖刺激ultrasensitive biosensors肾小管上皮细胞(m TEC)、足细胞(MPC5)、内皮细胞(VEC)及系膜细胞(SV40-MES-13),利用RT-PCR检测不同细胞circRNA表达水平。同时我们采用荧光原位杂交(FISH)检测肾脏穿刺确诊DN患者的肾穿刺标本及癌旁肾标本中circRNA在肾小球的表达。运用生物信息学预测,桑格测序(sanger测序)验证circRNA的环状结构,运用放线菌素D(Actinomycin D)与核糖核酸酶(RNase)探究circRNA结构的稳定性。第二部分:采用sh RNA构建稳定过表达circ-0000953的足细胞系,Western blot(WB)检测高糖刺激的足细胞标志蛋白Nephrin和WT-1的表达水平,RT-PCR检测炎症因子TNF-α、IL-1β和MCP-1的表达,通过WB检测经典炎症转录因子P65的活化水平。为进一步阐明circ-0000953的功能,我们对高糖刺激的过表达circ-0000953的足细胞进行转录组学测序筛选出变化最为显著的自噬通路,利用WB,免疫荧光与透射电镜检测高糖诱导的各组足细胞自噬变化。体内实验中,我们分别运用腺相关病毒(AAV9)在1型和2型糖尿病小鼠过表达circ-0000953,同时我们构建肾脏足细胞条件性敲入circ-0000953小鼠,检测小鼠一般指标、24小时尿白蛋白的水平,PAS染色观察肾组织损伤程度,透射电镜观察肾小球超微结构改变,免疫组化(IHC)、WB检测足细胞标志蛋白的表达变化,WB,免疫荧光双染与RT-PCR检测肾组织炎症与自噬水平。接着我们通过在1型糖尿病小鼠上沉默circ-0000953反向验证其功能。检测小鼠一般指标、24小时尿白蛋白的水平,观察肾组织损伤程度及肾小球超微结构改变,检测足细胞标志蛋白与肾组织炎症与自噬水平。第三部分:我们运用生物信息学预测,RNA-pulldown联合RT-PCR筛选出circRNA结合的miRNA。运用荧光素酶报告实验验证circ-0000953与miR-665-3p的结合。在体内、体外实验中,沉默miR-665-3p验证其功能。检测小鼠一般指标、24小时尿白蛋白的水平,PAS染色观察肾组织损伤程度,透射电镜观察肾小球超微结构改变,IHC、WB检测足细胞标志蛋白的表达,WB,免疫荧光双染与RT-PCR检测肾组织炎症与自噬水平。利用挽救(Rescue)实验进一步阐明高糖刺激的足细胞中circ-0000953通过miR-665-3p发挥保护作用。利用targetscan预测网站分析miR-665-3p靶蛋白为自噬相关蛋白Atg4b,运用荧光素酶报告实验与生物信息学预测验证miR-665-3p与Atg4b的结合。在体内体外实验中,过表达Atg4b验证其功能。检测小鼠一般指标、24小时尿白蛋白的水平,PAS染色观察肾组织损伤程度及电镜观察肾小球超微结构改变,IHC、WB检测足细胞标志蛋白的表达变化,WB,免疫荧光双染与RT-PCR检测肾组织炎症与自噬水平。第四部分:运用生物信息预测网站预测circRNA的m6A甲基化位点。运用RT-PCR检测足细胞条件性敲除METTL3的小鼠肾组织中circ-0000953表达量。运用荧光素酶报告探究circ-0000953与METTL3Rapamycin临床试验的相互作用。Me RIP-qpcr检测METTL3敲除的足细胞中,circ-0000953的m6A甲基化水平。采用si RNA沉默m6A阅读蛋白YTHDF2,探究其对circ-0000953表达的影响。结果:第一部分:circRNA在糖尿病肾脏体内体外的表达及差异分析为了探究circRNA在DN中的表达变化,我们在糖尿病小鼠肾脏中运用全转录组高通量测序及RT-PCR筛选了差异性变化的circRNA。我们发现STZ诱导后12周的糖尿病小鼠肾脏中circ-0000953变化最为显著。接着我们在高糖刺激肾脏固有细胞:肾小管上皮细胞(m TEC)、足细胞(MPC5)、内皮细胞(VEC)及系膜细胞(SV40-MES-13)验证circ-0000953的表达变化,RT-PCR结果证实circ-0000953主要富集在足细胞中,FISH实验证实其定位于足细胞细胞质中。生物信息学预测表明circ-0000953是由其亲本基因D19Ertd386e的2号外显子首尾剪切环化而形成。sanIDN-6556抑制剂ger测序证明了circ-0000953的环状结构,在放线菌素D与核酸内切酶处理下,circ-0000953也表现出比线性RNA更稳定的状态。为了探讨circ-0000953与临床糖尿病患者的相关性,我们通过FISH验证发现,糖尿病肾病患者足细胞的circ-0000953表达明显下降,且circ-0000953表达量与24小时尿白蛋白和肌酐成负相关,与估算的肾小球滤过率成正相关。第二部分:circRNA在糖尿病肾脏足细胞损伤中的功能研究在足细胞中过表达circ-0000953减轻了高糖诱导的足细胞标志蛋白的Nephrin和WT-1的丢失,抑制了炎症因子TNF-α、IL-1β和MCP-1的表达,同时也抑制经典的炎症转录因子P65的磷酸化水平。为进一步阐明circ-0000953的功能,我们对高糖刺激的过表达circ-0000953的足细胞进行转录组学测序筛选出变化最为显著的自噬通路,过表达circ-0000953减轻了高糖刺激的足细胞自噬水平的紊乱,增加了自噬关键蛋白Atg7,Atg4b,LC3的表达。体内实验中,在1型和2型糖尿病小鼠体内过表达circ-0000953,同时我们构建肾脏足细胞条件性敲入circ-0000953小鼠,我们发现circ-0000953表达增高,在不同程度上减轻了1型和2型糖尿病小鼠24小时尿白蛋白的水平,抑制了糖尿病诱导的小鼠肾脏损伤程度,同时减轻了足细胞标志蛋白的丢失。此外,我们发现过表达circ-0000953抑制了糖尿病小鼠肾组织炎症与自噬水平紊乱。接着我们通过在1型糖尿病小鼠上沉默circ-0000953反向验证其功能。我们发现沉默circ-0000953加重了糖尿病小鼠24小时尿白蛋白的水平与肾脏损伤程度,同时促进了足细胞标志蛋白的丢失。此外,我们发现沉默circ-0000953也进一步加重了糖尿病小鼠肾组织炎症与自噬水平紊乱。第三部分:circ-0000953介导糖尿病肾脏足细胞损伤的机制研究我们运用生物信息学预测与RNA-pulldown联合RT-PCR筛选出circRNA结合的miRNA,其中变化最为显著的是miR-665-3p。运用荧光素酶报告实验与生物信息学预测验证circ-0000953与miR-665-3p的结合。在体内体外实验中,我们发现沉默miR-665-3p减轻了小鼠24小时尿白蛋白的水平,抑制了糖尿病诱导的小鼠肾脏损伤程度,同时减轻了足细胞标志蛋白的丢失。沉默miR-665-3p也抑制了肾组织炎症与自噬水平紊乱。利用Rescue实验我们发现高糖刺激的足细胞中circ-0000953主要通过miR-665-3p发挥保护作用,在circ-0000953过表达的足细胞中进一步过表达miR-665-3p,circ-0000953无法进一步发挥其保护作用。我们利用targetscan预测网站分析miR-665-3p靶蛋白为自噬相关蛋白Atg4b,运用荧光素酶报告实验与生物信息学预测我们验证了miR-665-3p与Atg4b的结合。在体内、体外实验中,过表达Atg4b减轻了小鼠24小时尿白蛋白的水平,抑制了糖尿病诱导的小鼠肾脏损伤程度,同时减轻了足细胞标志蛋白的丢失,并抑制了肾组织炎症与自噬水平的失调。第四部分:m6A甲基化介导circ-0000953的作用及机制研究我们运用生物信息预测网站预测circ-0000953具有高度可信的m6A甲基化位点。接着我们运用RT-PCR检测足细胞条件性敲除METTL3的小鼠肾组织中circ-0000953表达量,结果表明敲除METTL3逆转circ-0000953的表达。荧光素酶报告证实了circ-0000953与METTL3的相互作用。Me RIP-qpcr发现METTL3敲除的足细胞中,circ-0000953的m6A甲基化水平下降。同时,我们沉默了m6A阅读蛋白YTHDF2,结果发现沉默了YTHDF2后减轻了circ-0000953的降解,回复了circ-0000953的表达。结论:1.本研究体外过表达circ-0000953明显逆转高糖刺激的足细胞的炎症及自噬受损,体内过表达circ-0000953显著减轻1型和2型糖尿病肾脏病理损伤及炎症及自噬受损。2.本研究发现circ-0000953通过miR-665-3p/Atg4b轴靶向调控糖尿病肾脏足细胞自噬。3.本课题进一步发现m6A甲基酶METTL3以YTHDF2依赖的方式调控circ-0000953的表达水平。