目的:超级细菌感染可导致脓毒症或脓毒症休克并引起患者死亡,严重危害人类健康。免疫细胞对细菌的清除作用在脓毒症抗感染免疫中发挥着重要作用,但是其中的分子机制尚未研究清楚。CD74是主要表达于MHCⅡ阳性抗原递呈细胞的免疫分子,一方面作为MHC II类分子伴侣,其能与II类分子的抗原肽结合槽结合,从而防止其他多肽在抗原蛋白到达内体隔室之前与MHCⅡ类分子交联;另一方面CD74还与多种疾病如肿瘤的发生和不良预后相关。然而CD74是否可调节细菌感染所致的脓毒症尚未明确。为此本研究采用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)构建小鼠脓毒症模型,通过对比分析C57BL/6(WT)和Cd74基因敲除小鼠(Cd74~(-/-))的存活率及脓毒症的相关表型,初步探讨Cd74对脓毒症病理进程的调控作用,进一步分选出WT和Cd74~(-/-)小鼠的中性粒细胞,采用转录组测序(Bulk-RNAseq)技术,对比分析这两种中性粒细胞不同基因的转录水平,探讨CD74对中性粒细胞影响的分子机制,从而为脓毒症治疗提供新策略。方法:(1)将WT小鼠(雄性,8～12周)分为对照组、低剂量组和高剂量组,采用尾静脉注射MRSA构建脓毒症模型。使用实时荧光定量PCR(q-PCR)检测小鼠在不同感染时间点的肝脏、肾脏、脾脏和肺组织Cd74 m RNA的转录水平。(2)将WT和Cd74~(-/-)小鼠(雄性,8～12周)分为低剂量组和高剂量组,采用尾静脉注射MRSA构建脓毒症模型,分别评估小鼠的生存率。同时在低剂量组小鼠感染48h时,对比检测小鼠的体重变化;使用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和诱导型一氧化氮合酶(i NOS)的浓度;对肝脏石蜡切片进行苏木素-伊红(HE)染色以观察病理损伤情况;同时对比检测肝脏、肾脏、脾脏和肺组织的荷菌量。(3)使用WT和Cd74~(-/-)小鼠,采用尾静脉注射MRSA构建脓毒症模型。在感染48h时,ELISA测定血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的浓度;流式细胞术检测肝脏的巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞的百分比;肝脏免疫组化染色观察中性粒细胞;通过尾静脉注射氯膦酸盐脂质体清除巨噬细胞,48h后肝脏免疫荧光染色观察巨噬细胞清除情况,再对每只小鼠注射MRSA,对比分析小鼠的死亡率。(4)流式细胞术检测正常WT和Cd74~(-/-)小鼠中性粒细胞的发育以及外周血和脾脏中性粒细胞的情况。进一步采用磁珠阴选方法从小鼠骨髓中分选出成熟的中性粒细胞进行Bulk-RNA转录组测序,通过华大基因多组学系统对比分析来源于WT和Cd74~(-/-)小鼠的中性粒细胞不同基因的表达。结果:(1)MRSA的感染使得小鼠肝脏、肾脏和脾脏中Cd74的表达升高。与对照组相比,不同浓度剂量的MRSA均可促进Cd74的m RNA转录。如低剂量组在感染24h和36h时肝脏中Cd74 m RNA的相对表达量分别显著升高了72.90%和84.25%(p<0.05);肾脏中分别显著升高了80.67%和90.82%(p<0.05);脾脏中Cd74 m RNA的相对表达量在感染12h、24h和36h时分别显著升高了57.69%、82.87%和85.26%(p<0.05)。此外与对照组相比,高剂量组在感染6h、12h和18h时肝脏中Cd74 m RNA的相对表达量分别显著升高7cross-level moderated mediation3.74%、84.50%和90.41%(p<0.05);肾脏中分别显著升高77.78%、84.08%和87.98%(p<0.05);脾脏中分别显著升高89.37%、90.12%和92.24%(p<0.05)。(2)敲除Cd74基因可减弱MRSA导致的脓毒症症状并显著延长小鼠的存活。在高剂量组和低剂量组中,与WT小鼠相比,Cd74~(-/-)小鼠的生存率要显著升高(p<0.05)。低剂量组在感染48h时,与WT小鼠相比,Cd74~(-/-)小鼠的体重变化较小(p<0.05);肝脏HE染色结果显示感染造成的坏死灶较小,并且有较多的炎性细胞浸润;血清中TNF-α、IFN-γ和i NOS的浓度分别显著下降了12.22%、1.85%和26.14%(p<0.05),IL-1β显RP56976供应商著上升了37.21%(p<0.05);肝脏和脾脏的荷菌量分别显著减少了98.37%和92.51%(p<0.05)。(3)敲除Cd74基因可显著增加MRSA感染小鼠肝脏中性粒细胞的数量。在感染48h时,与WT小鼠相比,Cd74~(-/-)小鼠AST和ALT的浓度无显著变化(p>0.05);肝脏中巨噬细胞和单核细胞无显著变化(p>0.05),中性粒细胞显著升高了46.76%(p<0.05);肝脏免疫组化染色结果显示中性粒细胞显著增多(p<0.05)。清除小鼠体内的巨噬细胞再构建脓毒症模型,显示敲除Cd74后仍可以显著延长脓毒症小鼠的存活(p<0.05)。(4)敲除Cd74基因使得IL-17信号通路相关基因的表达上调导致中性粒细胞募集增强。与对照组相比,感染组小鼠在48h时中性粒细胞表面CD74的蛋白水平并无显著变化(p>0.05)。与WT小鼠相比,Cd74~(-/-)小鼠中性粒细胞的发育并无显著变化(p>0.05);外周血和脾脏中的中性粒细胞分别显著升高了53.17%和33.79%(p<0.05)。对WT小鼠和Cd74~(-/-)小鼠的中性粒细胞进行转录组测序分析,以|log_2Fc|≥1.5与FDR≤0.001为筛选条件,得到了1499个显著差异表达的基因。其中有1393个基因在Cd74~(-/-)小鼠的中性粒细胞中表达显著下调,10获悉更多6个基因显著上调。GO富集分析和KEGG信号通路富集分析显示,显著上调的基因主要在IL-17信号通路上显著富集。结论:在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌构建的小鼠脓毒症模型中,敲除Cd74可以显著减弱脓毒症小鼠的症状,提高脓毒症小鼠的生存率。该效应的可能机制是通过上调IL-17信号通路中Il-1β、Cxcl1等相关基因的表达来促进中性粒细胞的募集,从而提高对细菌的清除效率。