第一部分急性髓系白血病CD34+干/祖细胞单细胞测序分析及亚群鉴定研究背景:急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)是起源于髓系造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病,以不同分化阶段受阻的造血祖细胞恶性克隆扩增为特征。AML是一种具有不同血液学表型异质性和分子复杂性的疾病,存在多种免疫表型和遗传学异常,因此,不同患者预后差异很大。AML造血干/祖细胞是发病的根源,并表现出肿瘤干细胞的特性,如自我更新、静止和异质性等。AML造血干/祖细胞的异质性造成了患者自身体内或患者之间的异质性,进而导致在疾病进展过程中对诱导化疗方案的不同反应。单细胞测序技术能够精确刻画不同细胞亚群的基因组学特征,揭示细胞异质性、分子多样性特征以及区分不同细胞亚群的生物学特征,为解析单个细胞的表征、行为机制等提供有力的技术支持。Savas P等对129例乳腺癌原发灶和转移灶进行了单细胞RNA测序,发现了一类新的肿瘤浸润性T细胞(TILs)亚群——CD8+TRM细胞,其参与了乳腺癌免疫监视,是免疫检查点抑制剂的关键靶点,与乳腺癌患者预后密切相关。Mathys等人在阿尔茨海默病中发现了与疾病相关的细胞亚群。Witkowski等人发现了一群位于骨髓微环境的非经典单核细胞亚群在促进B-ALL疾病进展和耐药中具有重要作用。本研究中,我们分选初诊AML患者的骨髓CD34+细胞,采用10× Genomics高通量单细胞转录组技术对数万个单细胞进行测序和数据分析,全面刻画了初诊AML患者和健康对照骨髓CD34+细胞的异质性图谱,利用各细胞亚群的广谱转录组特征区分了恶性相关细胞亚群和正常细胞亚群,每个恶性相关亚群具有其独特的分子功能特征。此外,根据初诊AML患者对化疗的不同反应,将初诊AML样本分为化疗敏感组和化疗抵抗组,通过对两组进行对比分析,我们发现了一群具有特定基因特征的预后不良相关的CD34+细胞亚群,以及两群具有特定标记的与化疗反应良好相关的CD34+细胞亚群,基于单细胞测序的分析结果,我们应用临床标本和数据库对结果进行了验证和进一步分析。本研究的发现揭示了与AML化疗反应相关的细胞亚群,并确定了其分子特征,为初诊AML患者预后的预测提供了新的机会。研究目的:利用新一代高通量单细胞测序技术,绘制AML单细胞基因组学图谱,进一步了解AML细胞遗传学特征;识别AML细胞中化疗反应相关的克隆亚群;确定其特征基因表达谱和细胞表面特异性表型;进而制定特异性的针对性的精准治疗策略,预测AML预后,解决AML耐药问题,寻找其“命运决定点”,进而为AML患者的个体化治疗、精准治疗提供依据。研究方法:1.收集临床确诊急性髓性白血病的标本,分离骨髓单个核细胞进行单细胞测序。(1)样本收集:收集初诊AML患者新鲜骨髓标本38例,诱导化疗第一周期后完全缓解(CR)AML患者21例,未缓解(NR)AML患者17例,(入组条件:年龄范围在18-80岁,无严重感染,无急性早幼粒细胞白血病,无骨髓增生综合征病史,无肿瘤化疗或放疗记录,白细胞计数<100×10 9/L,骨髓CD34+细胞百分率≥20%)。(2)样品准备:利用Ficoll梯度离心分离AML患者新鲜骨髓标本,获得骨髓单个核细胞。应用免疫磁珠分选出CD34+细胞。2.利用单细胞测序10×genomic技术,绘制急性髓性白血病单细胞图谱。(1)清洗细胞,进行细胞计数和活性检测。含有Barcode序列的Gel beads与样品和酶的混合物混合,然后与油表面活性剂结合形成GEMs(Gel Bead-In-Emulsions,意为包裹Gel beads,样品以及酶的混合物的油滴)。收集GEMs流到储液器,Gel beads溶解释放Barcode序列,开始对样本进行标记。将每个液滴中含有Barcode信息的产物混合,根据细胞量选择扩增循环数,进行cDNA扩增反应,纯化cDNA扩增产物,构建标准测序文库。(2)Cell Ranger分析流程:针对10X Genomics 3’单细胞转录组测序进行数据分析,包括细胞数目统计,单个细胞reads数目统计;质控分析,通过对UMI分析判定PCR扩增效率;基因表达定量;选用Seurat进行聚类分析;针对不同cluster中的基因进行差异分析。3.Marker genes鉴定:筛选出差异表达基因,鉴定出与诱导化疗反应相关的特异表型。(1)应用TCGA和GEO数据库对分析结果进行鉴定,从RNA-seq数据中选择平均表达水平差异最小的前100个基因作为背景基因集。然后,从每个标记基因的表达中减去背景基因集的平均表达值,并将标记基因集中每个基因得到的结果值的总和定义为AML患者的标记基因集积分。根据积分的中位数将患者分为高分组和低分组,然后进行生存分析。根据NCCN指南的诊断标准确诊,并进行了预后风险度分层,对纳入研究的患者同时评估了 AML常见的突变检测分析,包括FLT3、RAS、IDH1/2和NPM1。(2)应用临床标本对筛选出的对化疗敏感相关的细胞亚群进行鉴定,分别使用CD34+CD52+和CD34+CD74+DAP12+标记对化疗敏感相关的细胞亚群,从32位初诊AML患者的骨髓液样本中分离骨髓单个核细胞进行流式细胞学分析,其中17位患者在诱导化疗一周期后达到CR,因此归为化疗敏感组,而另外15位患者在诱导化疗一周期后出现NR,因此归为化疗抵抗组,比较两组化疗敏感相关亚群的细胞比例并分析与临床特征的相关性。研究结果:1.初诊AML患者CD34+细胞的图谱鉴定(1)AML与健康对照相比,CD34+细胞具有明显差异;个体之间相比,CD34+细胞具有明显异质性。然后我们通过无监督聚类的方法,根据基因表达谱的相似性,将所有60402个CD34+细胞聚类成17个不同的细胞亚群,结果说明CD34+细胞具有多样性和异质性。(2)通过对比每个细胞亚群的标记基因和干/祖细胞谱系的特征性基因,将CD34+细胞归为6种造血干/祖细胞类型,包括造血干细胞(hematopoietic stem cell(HSC))、多淋巴祖细胞(multilymphoid progenitor(MLP))、巨核-红系祖细胞(megakaryocyte-erythroid progenitor(MEP))、粒-单祖细胞(granulocyte-monocyte progenitor(GMP))、B 细胞前体细胞(pro-B cell(ProB))和早期胸腺祖细胞(earliest thymic progenitors(ETP))。2.初诊AML患者CD34+细胞中粒-单祖细胞(GMP)比例明显升高。(1)AML患者CD34+细胞各细胞类型的比例较正常对照有差异。从细胞类型方面分析,AML患者组的GMP的比例显著高于健康对照组,而HSC和pro-B的比例则明显低于健康对照组;对于细胞亚群,AML患者组中GMP-1、GMP-2、GMP-3、GMP-5、GMP-7的细胞比例明显高于健康对照组,而HSC-1、HSC-2、Pro-B-1、Pro-B-2、MEP-2则显著低于健康对照组。(2)挖掘AML患者CD34+细胞中恶性相关克隆亚群,如果一个亚群中大于60%的细胞来自健康对照组,我们将该亚群定义为正常细胞亚群(Normal-like cluster),其余细胞亚群则被定义为恶性相关细胞亚群(Malignant-like cluster)。因此,细胞亚群GMP-1～7、MEP-1、MLP和ETP-1被归类为恶性相关细胞亚群,其余细胞亚群被归类为正常细胞亚群。根据KEGG和GO细胞通路富集分析结果显示,恶性相关细胞亚群的基因表达谱明显在细胞周期、氧化磷酸化、细胞凋亡以及和癌症相关通路富集。3.初诊AML患者CD34+细胞的恶性相关细胞亚群具有明显的异质性。根据AML患者对标准诱导治疗方案(阿糖胞苷和蒽环类药物)的反应将6名AML患者分为两组,AML02、AML05、AML06和AML07在诱导治疗第一周期后达到完全缓解(CR),因此归为化疗敏感(Sensitive)组,而AML01和AML03在诱导治疗第一周期之后未缓解,因此归为化疗抵抗(Resistant)组。。(1)化疗抵抗组中恶性相关细胞亚群较敏感组具有明显差异,在每一个恶性相关细胞亚群中对比了两组转录差异,并对差异表达基因进行了功能富集。KEGG、GO和GSEA功能富集结果显示,与AML化疗敏感组相比,化疗抵抗组的恶性相关细胞亚群GMP-1、2、3、5、7和MLP在急性髓性白血病、细胞周期、氧化磷酸化和转录失控等通路明显富集,因此两组在恶性相关细胞亚群GMP-1、2、3、5、7和MLP中的基因表达谱具有明显差异。4.具有CRIP1highLGALS1highS100Ashigh分子特征的细胞次亚群与AML的不良预后相关。(1)为了挖掘出与AML治疗反应不良相关的CD34+细胞克隆,我们对上述6个细胞亚群(GMP-1、2、3、5、7和MLP)进行了再分群,并且比较了 AML化疗抵抗组、化疗敏感组以及健康对照组中的各次亚群的细胞比例。结果发现,细胞亚群GMP-1再分群后得到9个具有不同标记特征的的细胞次亚群,并且在次亚群GMP-1-0中AML化疗抵抗组的细胞比例明显高于化疗敏感组或健康对照组;细胞亚群GMP-3包括8个次亚群,在次亚群GMP-3-0中发现与GMP-1-0相同的结果。(2)确定了与预后不良相关的恶性克隆的分子特征,具有次亚群GMP-1-0或GMP-3-0标记基因(CRIP1highLGALS1highS100Ashigh)的细胞亚群是与预后不良相关的恶性克隆。(3)鉴定与预后不良相关的恶性克隆,利用TCGA数据库中134名初诊AML患者的RNA-seq数据,通过计算特定标记基因表达谱的积分,根据积分的高低将134名患者分为两组:高分组(n=67)和低分组(n=67)。通过对高分组和低分组进行生存分析,结果显示,与低分组相比,高分组的总生存(OS)显著降低(P=0.0195),这表明具有该特定标记基因表达谱的恶性克隆与AML的不良预后相关。5.另一种方式重分群也证实CRIP1highLGALS1highS100Ashigh亚群与AML的不良预后相关。(1)对AML患者的CD34+细胞重分群。为了排除健康对照样本的干扰,我们去除了健康对照样本,对AML患者的CD34+细胞单细胞数据进行了重分析,AML患者的CD34+细胞聚类成19个亚群。在亚群2、3、5和6中,大于60%的细胞来自化疗抵抗组。通过将亚群2、3、5和6的标记基因与干/祖细胞谱系特征基因进行匹配,我们发现亚群2、5、6与GMP相似,亚群3与MEP相似,因此我们分别将这些亚群的细胞类型定义为 GMP-like 和 MEP-like。(2)发现与上述预后不良相关克隆分子特征一致的亚群,亚群2中的标记基因谱与上述次亚群GMP-1-0和GMP-3-0的标记基因谱完美匹配,表明亚群2与这两个次亚群所聚类的细胞是同一细胞克隆亚群,所以,亚群2是一群与预后不良相关的细胞。为了进一步了解亚群2中特定标记基因的功能,我们进行了基因表达富集分析,发现标记基因谱中上调基因在细胞粘附、细胞增殖以及S100蛋白相关通路富集。(3)预后不良相关亚群的分子特征是独立的预后因素。化疗抵抗组中的两名患者(AML01和AML03)都有 MLL 重排,但在以 CRIP1highLGALS1highS100Ashigh为分子特征的亚群中没有发现MLL相关基因的显著富集。因此,我们推测与预后不良相关亚群的分子特征(CRIP1highLGALS1highS100Ashigh)是独立的预后因素。6.发现两群与AML化疗反应良好相关的细胞亚群,并表现出造血干细胞(HSC)细胞类型的特征。(1)比较每个细胞亚群中AML化疗抵抗组和敏感组的细胞比例时,我们发现亚群0和8中化疗敏感组的细胞比例远远高于化疗抵抗组。通过将亚群0或8的标记基因与干/祖细胞谱系特征基因进行匹配,我们发现亚群0和8表现出类似HSC的特征,因此将亚群0和8的细胞类型被定义为HSC-like。为了了解这两个亚群的功能,我们进行了基因表达富集分析,结果表明两个亚群的标记基因表达谱中上调的基因主要参与了辅助性T细胞分化和免疫反应等信号通路。(2)确定与化疗反应良好相关克隆亚群的分子特征,应用亚群0标记基因谱中的CD52对亚群0进行标记,应用亚群8标记基因谱中的CD74和DAP12共同对亚群8进行标记。7.通过临床标本和数据库对两群与AML化疗反应良好相关的细胞亚群进行验证。(1)流式细胞学结果显示,CR(化疗敏感组)患者初诊时CD34+细胞中CD52+细胞和CD74+DAP12+细胞的比例显著高于NR(化疗耐药组)患者。CD34+细胞中CD52+细胞>10%的AML患者诱导化疗后的CR率显著高于CD52+细胞≤10%的患者,CD74+DAP12+细胞>30%的患者诱导化疗后的CR率也高于≤30%的患者。分析了 32位AML患者的临床特征与诱导化疗反应的相关性,结果显示,骨髓原始细胞百分比、WBC、血红蛋白、CD34+细胞中CD52+细胞的比例、CD34+细胞中CD74+DAP12+细胞的比例与AML患者的诱导化疗反应具有统计学相关性。(2)通过TCGA和GEO数据库对与化疗反应良好相关亚群进行鉴定,分析了 TCGA数据库中134名AML患者和GEO数据库(GSE165430)中268名AML患者的RNA-seq数据,分别计算出亚群0和8特征基因的积分,将TCGA数据库的134名患者根据预后风险分层分为三组,预后良好组(n=17)、预后中等组(n=89)和预后不良组(n=26))。结果显示,与预后良好组或预后中等组相比,预后不良组的亚群0或亚群8的基因特征评分显著降低。然后,比较了 GSE165430中的复发患者(n=164)和保持CR≥ 3年患者(n=104)之间的基因特征积分,复发患者亚群0或8的基因特征积分低于维持CR的患者。结论:1.应用高通量单细胞转录组测序揭示了初诊AML患者中CD34+细胞的异质性。2.为了解AML CD34+细胞异常基因表达提供了新视野,揭示了化疗抵抗组和敏感组之间的显著差异,并确定了与化疗耐药和化疗敏感相关的特定细胞亚群。3.在初诊AML患者中发现与诱导化疗不同反应相关的CD34+细胞亚群,为在AML患者在初诊阶段预测诱导治疗的反应提供了新的理论支持。第二部分骨髓脂肪细胞异常分化在急性T淋巴细胞白血病微小残留病中的作用及机制研究研究背景:急性T淋巴细胞白血病(T-acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)一种由变异型T细胞前体细胞克隆性扩增引起的侵袭性恶性血液疾病,约占成人所有病例的25%。由于强化联合化疗(至少一种糖皮质激素、长春新碱和一种蒽环类药物)的使用以及根据患者的反应调整治疗方式,使T-ALL的治疗取得较大进展,完全缓解率很高,但复发也经常发生,多数患者出现难治、复发,最终导致治疗失败。60岁以下的成年人的五年存活率只有40%-50%,而年龄较大的患者的预后更差。复发的根本原因是微小残留病(minimal residual disease,MRD)的存在。骨髓微环境(Bone marrow microenvirent,BMM)是MRD的主要部位,可庇护残留白血病细胞,使其免受化疗药物的杀伤。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和脂肪细胞、内皮细胞、成骨细胞、成纤维细胞等共同构成骨髓基质细胞,是骨髓微环境的主要成份。最近的研究表明,骨髓脂肪细胞可通过向实体肿瘤细胞提供能量参与恶性肿瘤的发生发展;在多发性骨髓瘤中,骨髓脂肪细胞通过分泌衍生脂肪因子来保护多发性骨髓瘤细胞免受化疗诱导的细胞凋亡,并selleckchem DS-3201促进骨转移。脂肪细胞在白血病的存活、增殖、侵袭和耐药中也发挥重要作用。然而,骨髓脂肪细胞如何影响T-ALL细胞的存活,以及通过何种信号通路作用于T-ALL细胞目前尚无研究报道。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是脂肪细胞的前体细胞,一些化疗药物可促进BMSCs向脂肪细胞方向分化。例如,在急性髓系白血病中,骨髓间充质干细胞的自我更新能力降低,经阿糖胞苷(Ara-C)治疗后,容易分化为脂肪细胞和软骨细胞。然而化疗后T-ALL患Navitoclax纯度者骨髓脂肪细胞的变化情况未见报道,具体何种机制参与调控T-ALL患者化疗药物诱导的骨髓微环境的改变并不清楚。本研究中,我们应用5例成人T-ALL患者治疗前后一一对应的骨髓活检组织,比较了 T-ALL患者化疗前后骨髓活检病理的变化,发现T-ALL患者化疗后,骨髓中的脂肪细胞明显增多;进一步研究发现体外培养T-ALL患者的BMSCs加入化疗药物地塞米松(Dexamethasone,DEX)后,可促进其向脂肪细胞分化,细胞内脂肪滴明显增多。进一步证实BMSCs来源的脂肪细胞可以通过释放CXCL13趋化因子将T-ALL细胞募集到自身周围,进而通过脂肪细胞的DLL1配体与T-ALL细胞表面的Notch1受体结合激活T-ALL中的Notch1信号通路,支持和保护残留的T-ALL细胞。最后,我们筛选出DEX诱导BMSCs异常成脂分化的关键分子SREBF1,体内体外证实抑制SREBF1可以降低DEX对BMSCs成脂分化的促进作用。综上所述,DEX通过调节SREBF1的表达介导BMSCs向脂肪细胞分化,进而有助于募集保护化疗后残留的T-ALL细胞。揭示了化疗后骨髓脂肪细胞介导T-ALL微小残留病的新机制,对有效清除T-ALL微小残留病具有重要意义。本研究从骨髓微环境重构的角度,以降低T-ALL的复发率为目标,为T-ALL提供了潜在的治疗靶点。研究目的:探究化疗前后T-ALL患者骨髓微环境中脂肪细胞的变化情况;明确骨髓脂肪细胞如何影响T-ALL细胞的存活,以及通过何种信号通路作用于T-ALL细胞;探究参与调控T-ALL患者化疗药物诱导的骨髓微环境改变的机制。研究方法:1.证实T-ALL患者化疗后骨髓微环境中脂肪细胞较化疗前明显增多。收集5例初诊T-ALL患者标准诱导方案化疗前、后一一对应的骨髓活检组织,H&E染色比较化疗前、后T-ALL患者骨髓微环境中脂肪细胞比例。2.研究化疗药物对T-ALL患者BMSCs成脂分化的影响。(1)分离和培养T-ALL患者BMSCs:收集T-ALL患者骨髓液,Ficoll法分离骨髓单个核细胞,应用BMSCs培养基常规培养并传代2次。(2)分别应用去甲氧柔红霉素(IDA)、长春新碱或DEX持续处理BMSCs,同时加入含终浓度为0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、10μg/ml胰岛素的10%胎牛血清α-MEM培养,诱导BMSCs成脂分化,第7、14、21天用BODIPY荧光染色检测化疗药物处理前后BMSCs成脂分化能力的差异。3.研究化疗后BMSCs来源的脂肪细胞对T-ALL细胞生物学行为的影响。(1)分离化疗后T-ALL患者BMSCs,诱导其向脂肪细胞分化。(2)将上述BMSCs、脂肪细胞分别与T-ALL细胞系直接共培养。(3)研究共培养对T-ALL细胞生物学行为的影响:①加入Ara-C作用48h,收集细胞,应用AnnexinV/7AAD染色,流式细胞术检测T-ALL细胞凋亡率;②48h后收集细胞,应用甲基纤维素半固体培养基检测T-ALL细胞的集落形成能力;③48h后每组进行相同的清洗上层细胞的操作,镜下观察剩余T-ALL细胞与BMSCs或脂肪细胞的粘附情况。4.探索化疗后BMSCs来源的脂肪细胞对T-ALL细胞发挥保护作用的机制。(1)化疗后BMSCs来源的脂肪细胞通过释放CXCL13趋化因子将T-ALL细胞募集到自身周围1)上述直接共培养体系显示,在脂肪细胞周围聚集的T-ALL细胞数较BMSCs周围明显增加。Transwell趋化实验验证脂肪细胞对T-ALL细胞的募集作用。2)为探究该现象的机制,qRT-PCR分析与趋化相关分子的表达水平,发现趋化因子CXCL13在脂肪细胞中显著升高,并通过ELISA进行验证。3)将BMSCs、脂肪细胞分别与T-ALL细胞系直接共培养,24h后收集细胞,应用CXCR5抗体进行染色,流式细胞术检测T-ALL细胞CXCL13的受体CXCR5的表达情况。4)应用CXCL13的封闭抗体对其进行封闭后,Transwell趋化实验检测趋化因子CXCL13对脂肪细胞募集作用的影响。5)加入不同浓度的人重组CXCL13趋化因子,Transwell趋化实验检测CXCL13对T-ALL细胞的趋化作用。(2)化疗后BMSCs来源的脂肪细胞通过DLL1/Notch1通路介导对T-ALL细胞的保护作用1)将脂肪细胞与T-ALL细胞共培养,qRT-PCR、Western Blot检测共培养前后T-ALL细胞Notch1信号通路关键分子Notch1、Hes1、Hey1、NICD的表达。2)应用qRT-PCR检测BMSCs向脂肪细胞分化过程中Notch1配体JAG1、JAG2、DLL1、DLL3和DLL4的改变,Western-Blot检测DLL1的表达。3)应用Notch1表面受体封闭剂MHN519处理T-ALL细胞,将上述T-ALL细胞与脂肪细胞或BMSCs直接共培养:①加入1.2μM Ara-C作用48h,收集细胞,应用AnnexinV/7AAD染色,流式细胞术检测T-ALL细胞凋亡率;②48h后收集细胞,应用甲基纤维素半固体培养基检测T-ALL细胞的集落形成能力;③48h后每组进行相同的清洗上层细胞的操作,镜下观察剩余T-ALL细胞与BMSCs或脂肪细胞的粘附情况。5.探讨化疗药物促进T-ALL患者BMSCs成脂分化的机制。(1)筛选并鉴定化疗药物处理前后T-ALL患者BMSCs成脂分化过程中差异表达基因体外分离培养T-ALL患者BMSCs,分为两组进行处理:①BMSC组(BMSCs):应用含10%胎牛血清的α-MEM培养BMSCs;②成脂分化诱导后的BMSC组(Induced-BMSCs):加入含终浓度为0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、10μg/ml胰岛素、1μM地塞米松(DEX)的10%胎牛血清α-MEM培养,诱导BMSCs成脂分化。第21天收集细胞,提取RNA,进行RNA-Seq检测,筛选BMSCs成脂分化前后差异表达的基因。应用qRT-PCR、Western-Blot对结果进行验证。(2)研究干预SREBF1表达对T-ALL患者BMSCs成脂分化的影响通过差异分析和富集分析筛选出SREBF1分子,其表达量随着脂化程度增加而逐渐升高,分别应用慢病毒下调SREBF1或应用SREBF1抑制剂(Fatostatin HBr)处理BMSCs后,诱导BMSCs成脂分化,第7、14、21天油红O染色检测SREBF1对BMSCs成脂分化的影响。6.研究抑制BMSCs成脂分化过程对T-ALL细胞生物学行为的影响。(1)应用SREBF1抑制剂(Fatostatin HBr)对BMSCs脂肪分化过程持续进行干预,诱导BMSCs成脂分化21天。(2)将脂肪细胞、SREBF1抑制的脂肪细胞分别与T-ALL细胞系直接共培养,探究T-ALL细胞药物诱导的凋亡、增殖及粘附力的改变:①加入Ara-C作用48h,收集细胞,应用AnnexinV/7AAD染色,流式细胞术检测T-ALL细胞凋亡率;②48h后收集细胞,应用甲基纤维素半固体培养基检测T-ALL细胞的集落形成能力;③48h后每组进行相同的清洗上层细胞的操作,镜下观察剩余T-ALL细胞与BMSCs或脂肪细胞的粘附情况。7.探究抑制BMSCs成脂分化过程对T-ALL异种移植小鼠的影响。(1)构建T-ALL小鼠模型及给药方案用携带绿色荧光蛋白(GFP)的空载慢病毒转染人源T-ALL细胞系Jurkat细胞,流式分选GFP+细胞后扩增培养,选取6-8周龄的重度免疫缺陷小鼠,给予1.5Gy辐射照射,将GFP+的Jurkat细胞通过尾静脉注射接种至每只小鼠体内,建立T-ALL人源异种移植模型,持续应用流式细胞术监测小鼠外周血中GFP+细胞的含量,当外周血GFP+细胞的比例可监测到时,将小鼠分为3组,开始给药。第一组:Control组,给与对照溶剂治疗;第二组,DEX组,给与1.5mg/kg/d DEX治疗;第三组:DEX+SREBF1 抑制剂组,给与 1.5mg/kg/d DEX 联合 15mg/kg/d SREBF1 抑制剂(FatostatinHBr(FH))治疗。以每周连续给药5天停药2天为一个周期,一共给药5个周期,共35天。(2)小鼠外周血、脾脏、骨髓治疗效果的检测①每周期结束后应用流式细胞术检测小鼠外周血中GFP+细胞的比例;②第5个周期给药结束后给与小鼠安乐死,解剖动物,评估3组小鼠T-ALL细胞的脾脏和骨髓的浸润程度,进行治疗效果的鉴定。(3)探究小鼠骨髓中脂肪细胞含量随治疗过程的变化情况选取第3个周期和第5个周期结束后的小鼠,给与安乐死,提取小鼠的股骨,对小鼠的股骨进行病理组织学切片,H&E染色观察组织病理的差异以及脂肪细胞含量的差异。研究结果:1.证实T-ALL患者化疗后骨髓微环境中脂肪细胞较化疗前明显增多,化疗后T-ALL患者骨髓活检组织中脂肪细胞明显增多,通过定量分析发现,化疗后T-ALL患者骨髓活检组织中脂肪细胞的数量以及脂泡的面积大小均明显升高。2.标准诱导化疗药物对T-ALL患者BMSCs成脂分化的影响,IDA、Vincristine组较对照组BMSCs成脂分化比例无明显差异;不同浓度的DEX处理BMSCs,随DEX浓度增加细胞内脂肪滴明显增多,部分融合成泡,提示DEX作用后T-ALL患者的BMSCs成脂分化能力明显增强。3.化疗后BMSCs来源的脂肪细胞通过释放趋化因子CXCL13将T-ALL细胞募集到自身周围。(1)脂肪细胞对对T-ALL细胞具有募集作用。1)通过观察直接共培养体系中T-ALL细胞的分布规律,发现在脂肪细胞周围聚集的T-ALL细胞数较BMSCs周围明显增加。2)趋化实验发现脂肪细胞组中迁移进入下室的T-ALL细胞数较BMSCs组及空白对照组明显增加。(2)化疗后BMSCs来源的脂肪细胞通过释放趋化因子CXCL13吸引T-ALL细胞。1)qRT-PCR和ELISA实验验证了脂肪细胞中CXCL13的表达水平显著升高。2)与脂肪细胞共培养后,T-ALL细胞表面的CXCR5表达明显增加。3)封闭趋化因子CXCL13后,脂肪细胞对T-ALL细胞的募集作用减弱。4)人重组CXCL13促进T-ALL细胞的趋化。4.化疗后BMSCs来源的脂肪细胞对T-ALL细胞生物学行为的影响。(1)对T-ALL细胞粘附力的影响。与BMSCs共培养组相比,脂肪细胞共培养组粘附的T-ALL细胞明显增多,说明脂肪细胞较BMSCs对T-ALL细胞具有更强的粘附力。(2)对药物诱导T-ALL细胞凋亡的影响。与单独培养组或BMSCs共培养组相比,脂肪细胞共培养组中Jurkat、SupT1细胞的凋亡率明显降低,提示脂肪细胞能抑制化疗药物诱导的T-ALL细胞凋亡。(3)对T-ALL细胞集落形成能力的影响。与单独培养组及BMSCs共培养组相比,脂肪细胞共培养组中Jurkat、SupT1细胞的集落形成能力明显增强,提示脂肪细胞可促进T-ALL细胞的集落形成能力,说明与脂肪细胞短期共培养后,T-ALL细胞的较长期克隆性增殖能力明显增强。5.探究化疗后BMSCs来源的脂肪细胞对T-ALL细胞发挥保护作用的机制。化疗后BMSCs来源的脂肪细胞可促进T-ALL细胞Notch1信号通路的活化。与单独培养或BMSCs共培养相比,T-ALL细胞与脂肪细胞共培养后,Notch1、Hes1、Hey1和NICD的表达在mRNA水平明显升高,Notch1、Hes1和NICD的表达在蛋白水平明显升高。提示脂肪细胞可促进T-ALL细胞Notch1信号通路的活化。(1)化疗后BMSCs来源的脂肪细胞通过DLL1/Notch1受配体结合激活T-ALL细胞的Notch1信号通路。在诱导BMSCs成脂分化过程中,Notch1配体DLL1的表达水平随成脂分化明显升高。(2)化疗后BMSCs来源的脂肪细胞通过DLL1/Notch1受配体结合介导对T-ALL细胞的保护作用。应用Notch1表面受体封闭剂MHN519处理T-ALL细胞,将上述T-ALL细胞与脂肪细胞或BMSCs直接共培养,以T-ALL细胞单独培养作为对照,脂肪共培养组中,Notch1表面受体封闭组粘附细胞数明显低于对照组,T-ALL细胞凋亡率明显高于对照组,集落形成能力明显低于对照组,说明Notch1表面受体封闭剂阻断了脂肪细胞与T-ALL细胞之间Notch1受体与配体的结合之后,抑制了对T-ALL细胞Notch1信号通路的激活,进而逆转了脂肪细胞对T-ALL细胞的保护作用。6.DEX促进T-ALL患者BMSCs成脂分化的机制。(1)筛选并鉴定DEX处理前后T-ALL患者BMSCs成脂分化过程中差异表达基因。BMSCs组与诱导后BMSCs组之间具有明显的分子差异,共有3886个基因在两组之间有显著差异表达,其中包括1813个上调基因和2073个下调基因。然后,我们对诱导后BMSCs组中上调的1813个基因进行了 KEGG功能富集分析,结果显示这些上调的基因明显参与氧化磷酸化、脂肪酸代谢、不饱和脂肪酸的生物合成等,这些都与脂肪的形成有关。根据功能富集结果,进一步筛选出来与脂肪形成相关的209个基因,该209个基因在两组中的表达情况见图Immune reaction。其中SREBF1的表达在诱导后的BMSCs组中显著上调。通过qRT-PCR和Western-Blot对诱导后BMSCs中SREBF1的表达进行了验证,结果显示,与BMSCs组相比,SREBF1在诱导后BMSCs组中的表达量明显增加,与RNA-Seq结果一致。(2)干预SREBF1表达抑制DEX诱导的T-ALL患者BMSCs的成脂分化。应用SREBF1下调慢病毒(shSREBF1)或应用SREBF1抑制剂(Fatostatin HBr)处理T-ALL患者BMSCs,应用DEX诱导BMSCs向脂肪方向分化,随着诱导时间的延长,各组脂化细胞数和脂滴明显增多;当应用慢病毒下调SREBF1或应用SREBF1抑制剂进行干预后,DEX诱导的脂化细胞数和脂滴明显减少。7.抑制DEX诱导的BMSCs成脂分化过程对T-ALL细胞生物学行为的影响。应用SREBF1抑制剂后,随BMSCs脂化比例的降低,对T-ALL细胞的粘附力明显降低;T-ALL细胞药物诱导的凋亡率明显升高,存活细胞的比例明显降低;T-ALL细胞的集落形成能力明显降低。8.抑制BMSCs成脂分化过程对T-ALL异种移植小鼠的影响。为了研究SREBF1抑制剂在体内是否对DEX诱导的BMSCs成脂分化有作用,以及是否有助于T-ALL的治疗,我们应有NPG异种移植小鼠模型进行了体内实验。(1)小鼠外周血、脾脏、骨髓治疗效果的检测。①外周血在治疗第3周期结束时,与Control组相比,DEX组GFP+细胞的比例明显降低,DEX组展现出有统计学意义的治疗效果,但DEX+SREBF1抑制剂组与DEX组相比,无明显的治疗效果的差异。在治疗第4和5周期结束时,与Control组相比,DEX组GFP+细胞的比例明显降低,DEX组具有更明显的治疗效果;DEX+SREBF1抑制剂组与DEX组相比,联合用药组GFP+细胞的比例明显降低。②第5个周期给药结束后给与小鼠安乐死,与Control组相比,DEX组脾脏的大小和重量均明显减小,脾脏和骨髓中T-ALL细胞的比例也明显降低;DEX+SREBF1抑制剂组与DEX组相比,联合用药组脾脏的大小和重量均明显减小,脾脏和骨髓中T-ALL细胞的比例也明显降低。(2)小鼠骨髓中脂肪细胞含量随治疗过程的变化情况。T-ALL细胞的负荷情况与上述流式细胞术检测结果一致;与Control组相比,DEX组的脂肪含量明显高于Control组和DEX+SREBF1抑制剂组;第5周期结束时的DEX组的骨髓脂肪含量明显高于第3周期结束时的DEX组。结论:1.DEX在杀伤恶性细胞的同时不可避免地诱导骨髓脂肪细胞的生成。2.脂肪细胞通过释放CXCL13来吸引残留的T-ALL细胞,并通过DLL1/Notch1信号通路支持它们的生存。3.SREBF1抑制剂被证明可以显著减少BMSC来源的脂肪细胞生成以及其对T-ALL细胞的保护作用,因此抑制SREBF1可能是解决T-ALL复发困境的可行策略。