研究背景 随着纳米材料的制造和使用量的激增,职业人群长时间暴露于单壁碳纳米管(Single-walled carbon nanotubes,SWCNT)所带来的潜在健康危害日益受到人们重视。研究表明吸入SWCNT可诱导动物体内炎症反应和广泛的肺毒性,SWCNT暴露后可导致大量炎性细胞内流至肺部损伤部位。中性粒细胞(Polymorphonuclear neutrophils,PMNs)作为炎症的第一炎症反应细胞,长期以来被认为lipopeptide biosurfactant仅限于对抗急性感染和清除病原体;然而,已有研究表明肺纤维化与肺中免疫细胞PMNs密切相关,然而PMNs在介导SWCNT暴露所致肺炎和肺纤维化中的具体机制尚不清楚。目的1.阐明补体激活、PMNs积聚在SWCNT暴露诱导的肺部炎症以及肺纤维化中的作用。2.利用体内拮抗剂干预C5aR1产生,探究补体C5a-C5aR1通过调控PMNs的积聚介导SWCMCC950体内实验剂量NT诱导肺炎和肺纤维化的机制。方法1.观察评估SWCNT暴露后对肺脏损伤、补体激活和PMNs积聚的影CL 318952纯度响1.1观察评估SWCNT暴露不同时间对肺部炎症和肺纤维化的影响:8周龄C57BL/6J雌鼠随机分为对照组和SWCNT组,每组6-8只。通过单次气管滴注分别给予无菌PBS、40μg/只SWCNT建立模型,造模后继续喂养1天、3天、7天和28天,剖杀后取小鼠肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和肺脏组织,评估肺损伤的病理改变,肺部炎症因子白介素(interleukin,IL)-1β、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)-α表达水平,肺上皮间充质转化(Epithelialmesenchymal transition,EMT)相关分子波形蛋白(Vimentine)蛋白表达、成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化(Fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation,FMT)相关分子α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,SMA)和胶原蛋白I(Collagen I)的表达水平。1.2观察评估SWCNT暴露不同时间对补体激活、C5a-C5aR1结合和PMNs积聚的影响:研究利用方法1.1中获取的小鼠BALF和肺脏组织,评价补体成分5a(complement component 5a,C5a)、C5a受体1(C5a receptor 1,C5aR1)和补体激活最终产物C5b-9的表达情况,以及C5a-C5aR1结合情况;并评价BALF中PMNs的比例变化情况。2.验证C5a-C5aR1通过调控PMNs的积聚介导SWCNT诱导肺炎和肺纤维化:因第1部分发现SWCNT暴露1天后C5a、C5aR1和PMNs表达水平均显著升高,并促进早期急性炎症发生,因此我们选择1天、28天两个时间点进行体内拮抗剂干预探究。8周龄C57BL/6J雌鼠随机分为对照组、SWCNT组、PMX205组、SWCNT+PMX205组(每组6-8只),对照组和SWCNT组分别气管滴注给予无菌PBS、40μg/只SWCNT;PMX205组皮下注射给予1mg/kg C5aR1特异性拮抗剂PMX205,SWCNT+PMX205组在气管滴注40μg/只SWCNT基础上,每隔24小时皮下注射1mg/kg PMX205一次至取材。小鼠处理后喂养1天和28天,剖杀收集肺泡灌洗液并取肺脏组织,评价补体激活水平、C5a-C5aR1结合情况和BALF中PMNs的比例变化情况,评估肺部炎症和肺EMT和FMT水平。结果1.SWCNT暴露诱导小鼠早期肺部炎症和晚期肺纤维化SWCNT暴露诱导小鼠肺脏损伤并呈现不同时程特点。SWCNT暴露后第1-7天肺组织中大量炎性细胞浸润、炎症因子含量增加、肺支气管壁逐渐增厚;SWCNT暴露后第28天肺支气管、细支气管周围出现大量条索状胶原纤维沉积,肺组织HYP含量增加;同时肺EMT、FMT特征性分子的表达显著上调。2.SWCNT暴露诱导小鼠肺内补体激活和C5a-C5aR1共表达SWCNT暴露诱导补体激活并呈现时间-效应关系。SWCNT暴露后第1天和3天明显上调补体成份C5a和补体激活产物C5b-9表达,其中第1天最为显著;第7天至第28天表达逐渐减少。C5a-C5aR1共表达荧光强度在第1天时最为强烈、3天、7天和28天时共表达荧光强度逐渐减弱。3.SWCNT暴露诱导小鼠肺内PMNs积聚SWCNT暴露诱导肺内PMNs积聚并呈现时间-效应关系。流式细胞术检测结果显示,SWCNT暴露后第1天PMNs比例明显升高,第3天仍保持较高比例,第7天和第28天逐渐下降。同时SWCNT暴露后第1天诱导PMNs趋化因子白介素-8(interleukin-8,IL-8)明显升高,3天、7天和28天时回落至较低水平。4.PMX205处理阻断SWCNT暴露诱导的早期补体C5a-C5aR1结合PMX205特异性下调SWCNT暴露早期C5aR1的产生,并减少C5a-C5aR1的结合。皮下注射PMX205处理1天后,对SWCNT暴露诱导的C5a、C5b-9蛋白表达无明显影响,但可下调被SWCNT诱导的C5aR1蛋白表达;同时,免疫荧光检测C5a-C5aR1共表达的荧光强度明显减弱。然而PMX205对SWCNT暴露28天后补体C5a、C5b-9水平和C5a-C5aR1共表达情况无明显影响。5.C5a-C5aR1调控SWCNT暴露诱导的肺内PMNs积聚PMX205特异性阻断小鼠体内C5a-C5aR1结合,C5a无法参与SWCNT暴露早期趋化PMNs的炎症免疫进程。皮下注射给予拮抗剂处理1天后,PMX205减少了SWCNT暴露诱导的PMNs积聚;处理28天后对PMNs积聚无明显影响。6.C5a-C5aR1调控PMNs积聚进一步缓解SWCNT暴露诱导的肺炎和肺纤维化PMX205阻断C5a-C5aR1结合并减少PMNs积聚,我们发现在抑制剂处理1天后PMX205减少了SWCNT暴露诱导的炎性细胞浸润、炎症因子mRNA表达水平;在第28天,PMX205部分缓解了SWCNT暴露诱导的肺组织胶原沉积,肺EMT和FMT相关分子蛋白表达下调。结论1.SWCNT暴露诱导补体激活,增加C5a-C5aR1结合并调控PMNs积聚,促进早期肺部炎症并介导晚期肺纤维化。2.C5aR1的特效抑制剂可以抑制C5a-C5aR1结合,减少PMNs积聚,从而减轻SWCNT暴露早期肺部炎症,进而缓解晚期肺纤维化。