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1.1实验动物
8 周大雄性 C57BL6/J 小鼠，购自于上海斯泰克实验动物中心。 所有动物实验均严格按照浙江工商大学实验动物保护和使用委员会规定， 并遵循中国实验动物的护理和使用指南。
1.2试剂与仪器
无 Ca2+、Mg2+磷酸盐缓冲液（DPBS），吉诺生物技术有限公司；Matrigel 基质 （CB40230C）， 美国Corning 公司；1 mol/L HEPES 缓冲液（15630080）、DMEM/F12 培养 基 （11320-033）、青 霉 素/链霉 素溶液 （15140-122）、B27 添加剂 （17504044）、N-2添 加 剂 （17502048）、Glutamix 添 加 剂 （35050 – 061）， 美国 Gibco Thermo Fisher Scientific 公司；人类重组 EGF（315-09），美国 Peprotech 公司；Y- 2763 PD03259012 二盐酸盐（Y0503）、N-乙酰基-L-半胱氨酸（A7250）， 美国 Sigma Aldrich 公司；R-spondin 条件培养基 （来自于 R-spondin 细胞系），Dr. Jeffery Wittsett 实验室；Noggin 条件培养基（来自于 HEK- 293 Noggin 细胞），Dr. Peihua Jiang 实验室；细胞回收液（354253），美国 Corning 公司；RNA 抽提试剂 盒 （12-183-018A）， 美 国 Invitrogen Thermo Fisher Scientific 公司 ；VILO 预 混 液 （11755050）、PCR 试 剂 盒 （13001013）， 美 国 Thermo Fisher Scientific 公 司 ；4% 多 聚 甲 醛 （BL539A），Biosharp兰杰柯科技有限公司； SuperBlock 封闭缓冲 液（37515），美国 Thermo Fisher Scientific 公司；OCT包埋剂（4583），美国 Sakura Finetek 公司；封片剂（F6182），美国 Sigma Aldrich 公司。 本试验所用抗体信息见表 1。
SP8 激光共聚焦显微镜、DMI8 倒置荧光显微镜， 德国徕卡公司；Herace VOPS 250i 二氧化碳培养箱、T100PCR 仪，Thermo 公司；L550 低温离心机，湘仪公司；YCTS-103H 回旋式摇床，上海捷呈实验仪器有限公司。
1.3试验方法
1.3.1小肠隐窝分离 8~10 周 大 雄 性 C57BL/6小鼠 CO2 处死， 腹部剖开获得完整小肠放于 4 ℃预冷的 DPBS 溶液中； 去除小肠外壁连接组织后
将小肠纵向剖开，冷 DPBS 清洗后将小肠按照图 1所示分成十二指肠，空肠，回肠 3 份取 3~4 cm，眼科剪将各段小肠剪成 3~5 mm 小段置于 15 mL 离心管中冷 DPBS 清洗至上清澄清； 随后弃上清加入 5 mmol/L EDTA 溶液，摇床 37 ℃，250 r/min 振荡 10 min；消化后 DPBS 清洗组织一次，弃上清，加入适量 DPBS 振荡 20~30 次， 自然沉降后将上清过 100 μm 细胞筛转移至新离心管中，可重复上述振荡收集步骤 1 次， 合并上清； 将收集上清250×g，4 ℃离心 10 min，去除上清，沉淀中加入少量冷基础培养基 【含 1% 谷氨酰胺、1% HEPES、1% 青霉素/链霉素的 DMEM/F12 培养基】， 取 10 μL 计数隐窝数量，根据孔板接种数量调整隐窝浓度。
1.3.2隐窝培养及肠类器官传代 按照 24 孔培养板每孔 50 μL 剂量向分离肠道隐窝中加入相应的体积 Matrigel 基质，轻轻吹打形成均匀悬液。 将悬液接种于 37 ℃提前预热 24 孔板中， 后将培养板置于 37 ℃ CO2 培养箱 30 min，最后向每孔中加入 500 μL 完全培养基【85%~87%基础培养基、3% ~5% R-spondin 条件培养基、10% Noggin 条件培养 基 、 1xB27 （ % ）、 1xN2 （ % ）、 50 ng/ml EGF ，1 mmol/L N-acetylcysteine，10 μmol/L Y-27632）】，每 2 d 更换一次完全培养基。倒置显微镜及 Leica CCD 每天观察和记录隐窝形态变化及生长情况。接种 4~6 d 后小肠类器官可用于传代， 传代时去除点击此处培养基，每孔加 500 μL 冷 DPBS，反复吹打 60~ 100 次，4 ℃，300×g 离心 5 min， 去除上清并加入相应体积 Matrigel 基质，随后按照前述方法接种、更换培养基及记录类器官生长变化。

1.3.3免疫荧光 培养第 5 d 类器官， 去除培养基后加入 500 μL 冷细胞回收溶液，将培养板置于冰上回转式摇床 40 r/min 振荡 1 h； 后 800 r/min离心机瞬离取沉淀回收类器官；沉淀中加入 4%多聚甲醛室温固定 15 min， 随后 0.01%亚甲基蓝溶液室温孵育 20 min， 离心后沉淀中加入 20%蔗糖溶液 4 ℃过夜； 第 2 天 OCT 包埋剂包埋，Leica 冰冻切片获得类器官冷冻切片，切片厚度 5 μm。 PBS清洗玻片，加入抗原封闭液（含有 2%驴血清、0.3%
Triton X-100 的 SuperBlock 封闭溶液）室温孵 30 min；加入一抗 4 ℃过夜（一抗种类及稀释比例如表 1 所示）；PBS 清洗 3 次（每次 5 min）后加入二抗室温孵育 30 min；PBS 清洗 4 次（每次 5 min）后DAPI 复染， 封片剂封片后 Leica SP8 激光共聚焦显微镜获取图像。 隐窝分离试验获取肠段时，同时取 0.5~1 cm 肠段用于获取冰冻切片， 获取组织4%多聚甲醛 4 ℃固定 2 h，PBS 清洗组织 3 次 （每次 5 min），后续冰冻切片获取、免疫荧光及图像获取方法与类器官相同。E7080分子式
1.3.4RT-PCR 传代培养 5~6 d 小肠类器官，去除培养基后加入 500 μL 冷细胞回收溶液，将培养板置于冰上回转式摇床 40 r/min 振荡 1 h； 后 800 r/min 离心机瞬离取沉淀回收类器官。 类器官和肠道组织通过 RNA 抽提试剂盒获取 RNA，VILO 合成 cDNA，PCR 试剂盒获得目标产物，琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 结果， 基因测序确定序列正确性。PCR 所用引物如表 2 所示。

小肠作为人体最大的营养物质消化和吸收器官，由于其在代谢紊乱疾病，如肥胖及糖尿病的重要作用，因此人们对肠道营养物质吸收、转运、感受和激素释放的兴趣日益增长[1]。 作为人体更新速度最快的器官之一，肠道上皮细胞平均寿命为 4~ 6 d[2]，肠道上皮更新受到内在和外在因素影响。 肠道微生物和食物是影响肠道上皮平衡的主要外在因素，由于肠道长期暴露于各种饮食成分中，肠道上皮细胞与饮食成分密切接触， 直接受摄入食物成分的调节， 因此确定饮食成分如何与肠道上皮相互作用至关重要[3]。 一种能够再现体内真实肠道上皮结构及细胞组成的体外研究模型必定成为加速上述研究的宝贵工具。ABT-199化学结构
过去， 用于肠道食物成分吸收和营养物质功能评价的体外模型主要包括： 以离体肠道组织为基础的组织模型和以各种转化的肠道细胞系为基础的细胞模型。 以肠道组织为基础的模型，包括外翻肠囊、尤斯灌流室和离体肠灌注等，上述模型需要获取离体组织， 在试验对象数量有限情况下无法获得足够质量及数量的组织， 且离体组织功能测试试验有时间限制性， 试验的重复性及稳定性
差。 此外，为了获取足够的数据而大大增加动物使用量，从而增加试验成本和动物使用伦理风险。 以肿瘤细胞系为基础的细胞模型， 包括各种转化的肠道上皮细胞系，如 Caco-2、HT29 等，虽Alpelisib然细胞基础上的模型能够克服上述以动物组织为基础的模型的部分缺陷， 但是细胞基础上的模型细胞组成单一，无法真正再现肠道细胞与细胞之间、细胞与细胞基质之间的相互作用[4]。 目前亟待建立一种有力的肠道体外培养模型。
2007 年，Hans Clever 实验室发现了 Lgr5 标记的肠道干细胞， 此细胞的发现为新型肠道体外研 究 模 型 的 建 立 提 供 了 基 础 [5] ，2009 年 ，Hans Clever 实验 室 报 道 了 人 和 小 鼠 来源的 肠 类 器 官（Organoid）的产生和长期体外培养[6]，此类器官再现了肠上皮的所有细胞类型组成， 目前该技术被广泛应用于疾病模型、药物筛选、再生医学及干细E7080
[7-12]。 相对于上述领域，类器官在食品
[3，13-20]。 尤其是在国内，除了少数医学及药物学研究领域实验室掌握了肠道类器官培养技术外， 在食品研究领域能够熟练掌握上述技术的研究人员较少， 尤其是完善的针对于不同区段的小肠类器官培养方法。 本研究以含有肠道干细胞的肠道隐窝为基础， 通过优化隐窝分离方法和类器官培养基组成， 旨在建立一套完整的不同区段小肠类器官培养方法， 并通过免疫荧光及 RT-PCR 验证体外培养类器官再现体内肠道细胞及结构组成特点。

肠道是食物营养物质消化吸收的主要器官， 良好的肠道体外培养模型有助于推动新型食物营养物质及功能活性物质https://www.selleck.cn/products/r428.html的吸收及功效评价方法建立。 本文以含有肠道干细胞的肠道隐窝为基础，通过优化不同区段小肠隐窝分离方法和体外培养基组成，建立一套完整的不同区段小肠类器官（包括十二指肠、空肠和回肠）培养方法。EPZ-6438使用方法 采用免疫荧光和 RT-PCR 方法进一步证明不同区段小肠类器官与相应肠道组织具有相似结构特征及细胞组成，而且这些性状在传代过程中具有稳定性。 结论：本文建立的不同区段小肠类器官培养方法，可能为食品领域研究营养物质功能评价及吸收评价提供良好的体外研究工具。Axl抑制剂

<正>环状RNA(circular RNA,circRNA)是一组分子呈封闭环状结构，且不具有编码功能的转录本。由于其共价闭合的环结构，没有3’和5’末端，因此不易被外切酶降解[1]。与线性RNA比较，它更为保守和稳定，广泛存在于真核细胞的细胞质Ipatasertib说明书中。1976年，Sanger HL等[2]首次在植物病毒中发现了单链共价闭合cirY-27632抑制剂cRNA分子。但受限于当时的技术水平，circselleck激酶抑制剂 RNA一度被认为是没有生物学功能的错误剪接体。随着测序技术的发展，circ RNA在表观遗传学、转录调控和转录后调控等方面得到了越来越多的认识。研究表明，circ RNA异常表达会导致机体的紊乱，

今年4月15日至E708021日是第MK-1775临床试验28个全国肿瘤防治宣传周，主题是“癌症防治早早行动”。近年来，我国肿瘤患者5年生存率明显提升，但是受人口老龄化、生活方式改变等因素影响，部分癌症的发病率和Y-27632 NMR死亡率仍在升高。记者在采访中了解到，造成我国部分肿瘤病种死亡率居高不下、发病率还在?

铂类药物是乳腺癌化疗中的常用药物，通过规范化疗方案和合理优化治疗策略，可延长晚期患者的生存时间，改善预后。中国医师协会肿瘤医师分会乳腺癌学组为指导铂类药物在晚期乳腺癌中的临床应用，制定了《铂类药物晚期乳腺癌应用专家共识（2Selleck ABT 199020版）》。本文针对该E7080采购共selleck HPLC识进行解读，为晚期乳腺癌个体化诊疗提供科学依据。

目的 探讨聚乙烯醇载去甲斑蝥素微球对肝癌大鼠的影响及可能机制。方法 将造模成功的44只肝癌大鼠随机分为模型组（14只）、聚乙烯醇载去甲斑蝥素组（15只）、去甲斑蝥素组（15只），另设正常组（15只）。聚乙烯醇载去甲斑蝥素组肝动脉注入载去甲斑蝥素的聚乙烯醇微球10mg·kg~(-1)，去甲斑蝥素组仅注入去甲斑蝥素0.43mg·kg~(-1)，模型组和正常组经导管分别注入1.5mL·kg~(-1)生理盐水。干预7d后，测大鼠体重、肿瘤质量及抑瘤率；ELISA检测白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α和IL-6水平；TUNEL染色检测肝癌细胞凋亡；WesternBlot检测核因子（NF）-κB、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）、NF-κB抑制蛋白（IκB）-α、p-IκB-α、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bax）相对表达水平。结果 与模型组比较，聚乙烯醇载去甲斑蝥素组和去甲斑Selleck Alpelisib蝥素组大鼠体重Rapamycin使用方法减轻，肿瘤质量、IL-1β、IL-6和TNF-α水平、p-NF-κB和Bcl-2蛋白相对表达量降低，细胞凋亡率、p-IκB-α和Bax蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与去甲斑蝥素组比较，聚乙烯醇载去甲斑蝥素组大鼠体重减轻，肿瘤质量、IL-1β、IL-6和TNF-α水平、p-NF-κB和Bcl-2蛋白相对表达量降低，细胞Selleck LY2835219凋亡率、p-IκB-α和Bax蛋白相对表达量升高（P＜0.05）。结论 聚乙烯醇载去甲斑蝥素微球介入对肝癌大鼠具有抑瘤作用，其可能通过抑制NF-κB信号通路发挥作用。

在我国，无论城市还是农村，恶性肿瘤都是我国居民死亡的主要原因。间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）具有多向分化潜能、自我更新能力和良好的免疫调节特性。而外泌体作为MSCs旁分Alpelisib小鼠泌的重要物PD0325901细胞培养质，在肿瘤微环境中介导细胞间的信息交流与传递，影响肿瘤的发生发展。有研究报道了MSCs及其来源的外泌体对肿瘤的影响具有相互矛盾的发现，一方面MSCs及其外泌体具有肿瘤趋向性，能够靶向特定部位抑制肿瘤生长；另一方面也有证据表明Apoptosis抑制剂MSCs具有致瘤性，作为肿瘤微环境的一部分影响肿瘤的生长和迁移。本文将综述MSCs及其外泌体与肿瘤发生发展的关系以及MSCs及其外泌体如何在肿瘤发生发展中扮演不同角色，以期为肿瘤的诊断、预后和精准治疗提供有益的帮助。

目的探究ATP6V1C1在肝细胞癌(HCC)表达情况及功能。方法本研究为基础研究, 利用来自癌症基因组图谱数据库基因表达总库(GEO)测序数据, 找出HCC差异表达基因(P0.01, |logFc|≥1), 进一步利用来自于癌症基因组图谱(TCGA)在线数据UALCAN、Timer分析ATP6V1C1在HCSelleck Y27632C不同分期的表达情况及不同表达水平的预后情况, TGDC-0068he Human Protein Atlas分析正常肝组织与肿瘤组织免疫组化。TCGA数据库包含女性患者121例, 男性患者281例, 年龄16～81岁, 数据分析后台自行完成。KEGG信号了解ATP6V1C1对相关通路的影响。构建pcDNA3.1(+)-ATP6V1C1载体, 购买siRNA干扰片段体外研究ATP6V1C1对肝细胞癌的影响。统计学方法采用独立样本t检验。结果生物信息学分析提示ATP6V1C1在多种癌症中上调(P0.05), ATP6V1C1的表达水平与HCC的肿瘤分级有关, 在肝癌患者中, ATP6V1C1表达上调患者相对下调患者预后更差(P0.MK-1775价格05)。过表达ATP6V1C1后明显促进HCC细胞的侵袭、迁移、增殖及克隆形成能力, 同时, 干扰ATP6V1C1抑制HCC细胞的侵袭、迁移、增殖及克隆形成能力。结论 ATP6V1C1在HCC中表达与预后相关, 这个研究为HCC提供了新的可能诊断及治疗靶标。

目的 分析外泌体环状RNA(circular RNA，circRNA)在肝癌患者血清中的表达谱差异及临床意义。方法 对上海市公共卫生临床中心2018年收治的3例肝癌患者和3例健康志愿者血清样本，利用总外泌体分离试剂盒分离血清中的外泌体，利用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析和Western blotting对外泌体进行鉴定，利用高通量芯片技术检测circRNA表达谱差异。采用实时定量PCR方法验证62例肝癌患者血清circRNA分子的表达情况。分析表达异常的hsa＿circ＿0002018与肝癌患者临床病理特征的关系。结果 分离得到的外泌体为圆形、双层膜囊状的颗粒，粒径约100 nm，标志蛋白CD9/CD63表达显著。肝癌患者血清及健康志愿者血清的样本间差异表达的circRNA(相对表达量差异倍数>2且P<0.05)共2 094个，其中表达上Ipatasertib浓度调1 168个，表达下调的926个；验证结果显示 hsa＿circ＿0002018(circNFIC)在肝癌患者血清的表达显著增加(P<0.001)。circNFIC的异常高表达与肝癌患者发生肝外转移(P=0.003)、肝内转移(P=0.034)和肿瘤增大(P=0.019)显著相关，而与年龄、性别、AFP水平、肝硬化、BCLC分期和分化程度无显著关联性(P>0.05)。circNFIC高表达组患者的总体生存期显著低于低表达组患者[(24.35±3.09)个月 vs (31.49±2.95)个月，P<0.05]。结论 肝癌患者血清外泌体中circRNA表达谱发生显著变化，其中circAlpelisib临床试验NFIC水平升高与肝癌进展和生存密切相关，通过测定血清外泌体内circNFIC的水平有助于肝癌的临床Selleck Panobinostat诊断和预后判断。