禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)隶属于肠道外致病性大肠杆菌(Extra-intestinal E.coli,ExPEC),是引起禽类(如鸡、鹅、火鸡等)肠道外感染的常见病原体之一,可造成禽只局部炎症或以败血症为主的系统性感染,严重威胁养禽业的健康发展。在APEC入侵感染宿主的过程中,有多种毒力因子发挥着重要作用,如黏附素、铁摄取系统、保护素、荚膜、侵袭素等。外膜蛋白A(Outermembrane protein A,OmpA)作为外膜蛋白复合体(Outer membrane protein complex,OMPs)的主要成分之一,在维持细菌外膜结构的稳定性,参与代谢及调控,协助APEC的粘附和入侵,以及在参与宿主免疫调节等方面发挥着重要作用。自噬(Autophagy)是细胞进化的一种自我保护机制,可将错误折叠的蛋白质或损伤的细胞器进行降解,除了在维持细胞稳态中有重要作用外,自噬还能保护宿主抵抗病原体的侵害。而目前关于APEC OmpA对宿主细胞自噬作用的相关研究还未见报道。此外,研究发现热休克蛋白gp96(Glyeoprotein96)作为OmpA结合的受体,可协助脑膜炎致病性大肠杆菌入侵人脑微血管内皮细胞,破坏血脑屏障,从而引起脑膜炎的发生,而作为gp96同系物的鸡源热休克蛋白Hsp108(Heat shock proteins 108)能否协助APEC侵染宿主细胞,目前尚未得到验证。本研究从自噬的角度阐述APEC OmpA的致病机制,探讨OmpA是否协助APEC逃逸宿主细胞自噬介导的清除作用;并验证OmpA与Hsp 108蛋白的互作关系,进一步探究OmpA诱导自噬以及APEC侵染是否与Hsp108蛋白有关,为进一步研究APEC OmpA的生物学功能及其协助APEC逃逸宿主细胞的清除作用奠定基础。1禽致病性大肠杆菌外膜蛋白OmpA的原核表达及纯化首先构建原核表达质粒pET28a-ompA,转化至大肠杆菌BL21感受态进行诱导表达,随后经Ni-NTA亲和树脂对重组蛋白进行纯化,将纯化后的蛋白进行复性。将OmpA蛋白刺激鸡巨噬细胞HD11后观察APEC E058株在细胞内的增殖情况;利用qRT-PCR检测OmpA对HD11细胞炎症因子产生的影响。结果显示,成功构建原核表达质粒pET28a-ompA,经诱导表达及纯化后,获得分子量为38 KDa的重组蛋白OmpA-His。HD11细胞感染试验结果显示,OmpA蛋白对APEC E058株侵入宿主细胞及胞内存活发挥了重要作用。qRT-PCR结果显示,OmpA能够引起炎症因子IL-10、IL-6、IL-1β表达上升。2禽致病性大肠杆菌外膜蛋白OmpA对宿主细胞自噬的影响为弄清作为APEC重要的毒力因子OmpA是否协助其逃避宿主细胞的清除作用,本研究探讨了 APEC外膜蛋白OmpA对宿主细胞自噬的影响。以APEC E058株为模版,PCR扩增ompA基因,克隆到pEGFP-N1载体上,构建真核表达质粒,将其转染至DF-1鸡胚成纤维细胞并检测OmpA的表达情况,同时将重组蛋白OmpA-His直接作用于HD11细胞,采用透射电镜、免疫荧光及Western blot的方法检测OmpA对DF-1和HD11细胞自噬的影响。结果显示,将重组质粒pEGFP-N1-ompA经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,获得大小为1038 bp和4700 bp的2条带,大小与载体和目的片段相符,经测序鉴定正确,表明真核表达质粒pEGFP-N1-ompA构建成功。将重组质粒转染至DF-1细胞,经免疫荧光及Western blot检测,成功表达大小为65 KDa的EGFP-OmpA蛋白;同时Western blot结果显示,DF-1细胞中OmpA的过表达可引起自噬标志性蛋白LC3 Ⅱ表达增加,另外在OmpA蛋白外源性刺激HD11细胞后,在随着蛋白浓度的提高以及刺激时间的延长,LC3 Ⅱ蛋白表达水平呈上升趋势。通过透射电镜可观察到过表达OmpA的DF-1细胞中形成单层或双层膜的自噬囊泡,同时在转染了 GFP-LC3质粒的细胞中,呈现绿色荧光点的聚集,这些结果均证明APEC OmpA蛋白能够诱导宿主细胞发生自噬。进一步研究发现OmpA能够抑制AKT/mTOR/p70S6K蛋白的磷酸化,进而通过该信号通路诱导细胞自噬。此外,OmpA影响自噬标志蛋白p62的降解,RFP-GFP-LC3检测显示OmpA可阻断自噬流的发生;经LC3 Turnover试验,证明OmpA能够引起HD11细胞中LC3 Ⅱ蛋白的蓄积。以上结果表明OmpA可以诱导细胞自噬,但其抑制自噬流的发生,引发细胞的不完全自噬,这将为进一步探讨APEC逃逸宿主细胞的清除作用提供参考。3热休克蛋白Hsp108对APEC侵染及OmpA诱导自噬的影响为进一步弄清鸡源热休克蛋白Hsp108能否协助APEC侵染宿主细胞及参与OmpA诱导的自噬,本研究首先采用免疫共沉淀的方法验证OmpA与Hsp108蛋白的互作关系,接着利用CRISPR/Cas9技术对DF-1细胞hsp108基因进行敲除,构建hsp108基因敲除细胞系(hsp108/-DF-1);采用CCK-8检测hsp108基因敲除后,对DF-1细胞增殖的影响;将APEC E058株分别感染野medication history生型DF-1及hsp1 08-/-DF-1细胞,观察其入侵及胞内增殖情况;通过免疫荧selleck MRTX1133光观察Hsp108蛋白的亚细胞定位;最后通过Western blot检测在降低Hsp108蛋白表达的情况下,OmpA对DF-1细胞自噬的影响。结果显示,通过免疫共沉淀试验证实Hsp108蛋白与OmpA存在互作关系。利用pX458基因编辑质粒,成功对DF-1细胞的hsp108基因进行敲除,Western blot结果显示,Hsp108蛋白的表达量显著下降。同时CCK-8增殖试验结果显示,hsp108基因的敲除并不会影响细胞的增殖。将APEC E058株分别侵染野生型DF-1及基因缺失型DF-1细胞系,结果显示,hsp108基因的敲除,并不影响APEC入侵DF-1细胞的细菌数量,但显著提高了APEC在胞内的增殖水平。免疫荧光结果显示,Hsp108蛋白定位于细胞质中。在降低HspCompound C molecular weight108蛋白表达后,OmpA同样能够引起DF-1细胞发生自噬,表明OmpA并未通过Hsp108蛋白诱导细胞发生自噬。