臂丛神经根性撕脱伤(BPA)是累及相应节段脊髓和背根神经节的复合型损伤,也是一种累及中枢神经系统和周围神经系统的联合性损伤。BPA发生后常出现神经病理性痛(NPP),而NPP作为慢性疼痛的主要来源,其发病机制复杂(灼烧样疼痛)且难以治愈,还会诱发患者出现焦虑、抑郁等负性情绪。NPP与负性情绪两者之间互相共生,互相影响。BPA所导致的负性情绪发生率较其他骨科创伤的要高,即便是采取积极的手术治疗或者镇痛药物的干预,仍有大部分患者无法免于疼痛-负性情绪的折磨,在很大程度上影响了患者的正常生活。近年来,中枢神经系统对于疼痛及负性情绪调控的机制研究越来越多,微生物-肠-脑轴的关注度也持续上升;既往研究也表明NPP所导致的负性情绪与大脑的可塑性改变有着密不可分的关系,然而,有关BPA后NPP-负性情绪的研究还比较匮乏。因此,关注BPA后疼痛及相关负性情绪的共病机制,研究BPA后NPP-负性情绪的特点及发生原因,探索相关干预措施及治疗策略是骨手外科医生面临的重要问题,亟需开展相关基础研究。第一部分 BPA后NPP-负性情绪的特点及两者相关性分析目的 构建BPA模型小鼠并检测痛与负性情绪相关的行为学,明确BPA后NPP导致负性情绪的特点以及与NPP的相关性。方法 C57BL/6雌性小鼠,分为BPA组和Sham组,每组不少于10只,BPA组建立臂丛中干C7撕脱模型,Sham组仅暴露不撕脱。分别于造模前1d及造模后7 d、14 d、21 d对小鼠手术侧前足及后足进行机械缩足阈值和热缩足潜伏期检测,了解BPA后各时间节点的痛行为学情况;于相同时间节点进行平衡木和转棒实验检测,了解BPA后各时间节点运动能力情况;进行强迫游泳和悬尾实验,了解BPA后抑郁样行为情况;对其进行旷场和高架十字迷宫实验,了解BPA后焦虑样行为情况;通过相关性分析了解焦虑样行为与NPP的关系。结果 BPA后小鼠患足出现创伤后改变,部分小鼠出现自噬现象,BPA模型构建成功;痛行为学结果显示:BPA小鼠在术后7 d即出现明显机械缩足阈值下降,发生机械痛敏,同时这种痛敏状态可持续至术后21 d,未出现明显的热痛敏;各时间节点两组小鼠运动功能无差异;两组小鼠抑郁样行为无差异;旷场实验各时间节点的运动距离和运动速度均无明显差异,而BPA组7 d、14 d、21 d中心区域停留时间较Sham组明显下降,高架十字迷宫实验中BPA小鼠在各时间节点进入开臂次数和开臂停留时间较Sham组均明显减少;相关性分析发现焦虑样行为与NPP痛觉指标存在显著相关性。结论 BPA可诱发小鼠出现持续机械痛敏合并焦虑样行为,对小鼠运动功能无明显影响,未出现抑郁样行为,且焦虑样行为与NPP显著相关。第二部分 基于多组学分析探讨ACC区对BPA后焦虑样行为的调控机制目的 通过荧光示踪寻找上行控制情绪与疼痛的中枢并通过转录组和蛋白组多组学关联生物信息学分析寻找调控BPA后NPP-焦虑样行为的关键分子通路。方法 分别在前扣带回皮层和颈段脊髓背角立体定位注射含不同荧光的示踪剂,冰冻切片后观察相应区域荧光显示情况,观察两者之间有无相互投射关系;取对侧ACC区组织提取RNA进行转录组测序并进行数据分析;取对侧ACC区组织提取蛋白质进行蛋白组学测序并进行数据分析;将转录组学和蛋白组学进行关联分析寻找调控BPA后NPP-焦虑样行为的分子通路;将组学分析的关键基因通过qPCR和Western blot对其表达进行验证。结果 冰冻切片显示荧光顺标和逆标的示踪剂在ACC和SDH相互投射;转录组学样本相关性分析显示样本数据分布均匀,组间差异较大,组内差异较小;GO富集分析显示不饱和脂肪酸生物合成过程存在较大差异可能是BPA后焦虑样行为相关的GO term;KEGG富集分析发现花生四烯酸通路差异明显可能是BPA后焦虑样行为相关的KEGG Pathway;蛋白组学测序发现组间差异较明显,差异集中在蛋白质合成的调控和细胞表面离子通道相关term中,通过KEGG富集分析发现谷氨酸能突触,胆汁分泌,长期抑郁,5-羟色胺能突触可能与BPA后焦虑样行为有关;通过转录组和蛋白组关联分析发现ko04722神经营养素信号通路,ko04723逆行内源性大麻素信号可能是ACC区参与调控BPA后焦虑样行为的关键通路;对组学分析的关键基因进行mRNA和蛋白质表达的验证,qPCR和Western blot显示BPA组BDNF的mRNA和蛋白质表达明显上升。结论 ACC区可能是影响BPA后焦虑样行为的调控中枢。通过对ACC区多组学分析及验证发现神经营养素信号、逆行内源性大麻素信号中的BDNF可能是调控BPA后焦虑样行为的关键分子。第三部分 BDNF通过TrkB/PLC γ/eCBs/CB1R信号通路调控BPA后焦虑样行为的机制研究目的 通过对BDNF及其下游信号通路的干预探索其调控BPA后焦虑样行为的具体分子机制。方法 对BPA后14 d的小鼠脑组ABT-263 MW织进行HE、尼氏染色和透射电镜扫描,观察BPA是否导致神经元细胞凋亡;免疫荧光观察BDNF的表达;通过BDNF shRNA和BDNF蛋白调控BDNF表达并构建BPA小鼠,术后14 d进行焦虑样行为检测;通过KCC2 rLV-OE调控KCC2过表达并构建BPA小鼠,术后14d进行焦虑样行为检测;同时构建CB1R敲除鼠BPA模型,于术后14 d进行焦虑样行为检测;野生鼠和CB1R敲除鼠造模后补充BDNF蛋白,术后14 d进行焦虑样行为检测;通过Western blot检测TrkB、PLCγ、KCC2总蛋白和磷酸化蛋白表达;高效液相色谱法检测ACC区eCBs的含量。结果 HE、尼氏染色和透射电镜扫描结果显示BPA后14 d ACC区神经元细胞无明显损伤;上调BD确认细节NF表达可缓解BPA后焦虑样行为,下调BDNF表达加重BPA后焦虑样行为;KCC2过表达对BPA后焦虑样行为无干预效果;CB1R敲除加重BPA后焦虑样行为;Western blot结果显示BPA后TrkB、PLCγ磷酸化明显增加,而KCC2磷酸化无明显变化;敲除eCBs受体CB1R则BDNF蛋白抑制焦虑样行为作用明显受到干扰;高效液相色谱法检测ACC区eCBs含量发现BPA后ACC区eCBs含量升高;上调BDNF表达促进TrkB、PLCγ磷酸化,促进eCBs的释放,缓解BPA后小鼠焦虑样行为;下调BDNF表达减少TrkB、PLCγ磷酸化,减少eCBs的释放,加重BPA后小鼠焦虑样行为。结论 BPA小鼠早期神经元细胞无明显损伤。BPA后ACC区BDNF表达上调促进eCBs释放增加,eCBs通过CB1R对BPA后焦虑样行为产生抑制作用。ACC区BDNF通过TrkB/PLCγ/eCBs/CB 1R信号通路影响小鼠焦虑样行为。第四部分 微生物-肠-脑轴干预BDNF调控BPA后NPP-焦虑样行为的机制研究目的 通IVIG—intravenous immunoglobulin过肠道菌群16S和代谢组学检测了解BPA后小鼠肠道菌群,探索微生物-肠-脑轴对小鼠焦虑样行为的干预,补充益生菌观察对ACC区BDNF调控机制及BPA后疼痛与焦虑样行为的影响。方法 取BPA组和Sham组14 d回盲部粪便进行肠道菌群和代谢组学测序并进行生物信息学分析,结合菌群分析结果补充相应的益生菌观察其对ACC区BDNF蛋白表达,ACC区AEA,2-AG含量及BPA后痛阈、焦虑样行为的影响。结果 BPA后14 d肠道菌群和代谢组学分析结果显示罗伊氏乳杆菌及与其相关联的代谢产物AEA的表达下降明显,补充罗伊氏乳杆菌可提高BPA后小鼠的机械痛阈,提高ACC区AEA,2-AG含量,反馈性降低BDNF蛋白表达,缓解BPA后小鼠焦虑样行为。结论 BPA后肠道菌群及代谢产物紊乱,促进焦虑样行为发生,而补充益生菌可以通过微生物-肠-脑轴影响CNS对疼痛及焦虑的调控,形成了完整的反馈调节环路。