猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一种以仔猪严重腹泻、呕吐和脱水为临床症状的急性、高度接触性肠道传染病,2周龄内的仔猪最易感染,死亡率最高可达100%,严重影响养猪业的生产和发展,给养猪业造成严重损失。生理情况下,水在肠腔内大部分是通过渗透作用被吸收,当致泻物质作用于肠道时,存在于腔膜上的各种功能实体如离子转运体、通道和构成上皮屏障的多蛋白连接复合体的功能和/或表达丧失。这一系列的反应导致肠道内电解质吸收和/或分泌过程平衡的紊乱,进而破坏了渗透压梯度,导致水潴留和腹泻。NHE3通过将胞外Na~+转运到胞内、将胞外H~+转运到胞外来发挥其主要生理功能,实验室前期研究表明,TGEV感染猪小肠后在小肠上皮细胞(Porcine small intestinal epithelial cell,IPEC-J2)内大量复制,破坏了上皮细胞Na~+转运功能,导致肠道渗透压升高,并可促进仔猪腹泻,但其具体作用机制尚不清楚。而CD44的主要生理作用是介导细胞与细胞间及细胞与细胞外基质间的相互作用,可调控许多生物过程,包括细胞黏附、迁移和增殖,有研究表明CD44可参与病毒的感染,其在冠状病毒性疾病的致病过程中可抑制或促进病毒复制。基于上述原理,本immunofluorescence antibody test (IFAT)课题在细胞层面通过RT-q PCR、火焰原子吸收法、免疫荧光法等方法,检验TGEV感染情况下CD44与NHE3的数量变化情况;同时探索了NHE3数量及活性是否对TGEV有剂量依赖性;进而通过构建CD44过表达载体及干扰载体,探究CD44变化对病毒复制及NHE3活性/数量的影响,阐明了CD44在TGEV感染造成的Na~+失衡性腹泻中的作用;最后通过计算机辅助筛选出针对CD44蛋白激活剂考尼伐坦(Conivaptan),且体内实验证明Conivaptan有效阻止病毒的复制。主要RAD001体内实验剂量研究内容如下:1、TGEV感染猪小肠转录组学分析及验证本章通过对实验室前期TGEV感染仔猪肠道组织转录组学数据进行分析,发现肠道上皮细胞中负责Na~+/H~+交换体NHE3出现了显著下调,而细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)通路中的CD44出现了显著上调,实验也证明了TGEV感染可抑制NHE3 m RNA表达,促进CD44m RNA的表达;通过对CD44和NHE3进行蛋白互作预测,发现CD44与NHE3可能存在潜在联系。本章实验结果表明,NHE3和CD44可能存在调控关系。2、TGEV感染IPEC-J2细胞对NHE3和CD44的影响本章实验通过RT-q PCR、Western blot与免疫荧光等方法检测了NHE3、CD44的表达情况,并利用火焰原子吸收法检测了细胞内外液Na~+的交换情况。结果表明,TGEV可促进CD44的表达;TGEV可抑制NHE3的表达,影响IPEC-J2细胞对Na~+的吸收;通过用不同的感染复数(MOI=0.5,MOI=1,MOI=2)的TGEV感染IPEC-J2细胞,并利用上述方法检测NHE3的m RNA、总蛋白和膜蛋白水平,发现NHE3的表达对TGEV具有剂量依赖性。3、CD44对NHE3和TGEV复制的影响为探究CD44与NHE3的关系,本章通过构建CD44重组过表达质粒p EFGP-CD44和干扰质粒p LVX-CD44,同时利用Western blot与免疫荧光检测了CD44对NHE3表达的影响,结果发现CD44与NMCC950HE3间没有直接调控关系;在TGEV感染情况下,通过调控CD44检测NHE3蛋白的表达,并利用火焰原子吸收法检测了细胞内外Na~+浓度,结果发现,CD44蛋白可导致的NHE3质膜表达显著下调并影响细胞内外Na~+的交换;利用Western blot与TCID_(50)检测了CD44蛋白对TGEV复制的影响,结果发现CD44可以影响TGEV的复制,即过表达CD44能抑制TEGV的复制,而干扰CD44能促进TGEV的复制。上述结果证明,CD44可通过调节TGEV的复制影响NHE3的数量和活性。4、CD44小分子激活剂的筛选及效果验证从NCBI下载CD44蛋白的序列,利用Trrosetta基于蛋白质序列对CD44进行了蛋白质模型的构建;使用Smina等对CD44与候选配体进行了分子对接筛选到了潜在激活剂Conivaptan;细胞试验发现,4×10~(-4)mol/L的Conivaptan可显著激活CD44的表达;而在动物试验中,在对仔猪饲喂Conivaptan后使用TGEV感染,剖检后无明显病理变化。利用Western blot与绝对荧光定量PCR检测,结果发现Conivaptan可减少TGEV N基因在肠上皮细胞上的表达,也可降低TGEV感染后NHE3的减少,并有效阻止病毒的复制。综上所述,本研究证明了CD44可以介导TGEV调控NHE3,从而影响Na~+的交换,并筛选出了激活剂减弱TGEV引起的仔猪腹泻。在本研究中,我们旨在阐明CD44在TGEV感染过程中与NHE3之间的调控关系,确证CD44在TGEV致腹泻过程中发挥的作用。本研究将为设计以CD44为靶点的抗TGEV新药物和研发其他冠状病毒引起腹泻的药开辟新思路。