流感(Influenza)是由流感病毒引起的急性上呼吸道感染疾病,是我国高度关注的公共卫生问题。流感病毒属正黏病毒科,根据其核蛋白(NP)和基质蛋白(M)抗原性的不同,可分为A(甲型)、B(乙型)、C(丙型)和D(丁型)四种亚型。其中,A型流感病毒中的禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)普遍存在于禽类和人类中,可引起禽流感(Avian influenza),属于人畜共患类疾病。血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)是存在于禽流感病毒表面的两种重要抗原蛋白,根据两种表面蛋白的不同,将AIV划分为18个HA亚型和11个NA亚型。其中H7N9亚型AIV是对家禽危害最大的亚型之一,不仅危害禽类健康,导致生产及经济损失,且能够通过媒介感染人类,进而对人类生命健康造成巨大威胁,因此,建立一种针对H7N9亚型AIV的病原学快速检测方法就显得尤为重要。本研究以纯化的H7N9亚型AIV免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选获得稳定分泌抗H7N9亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞14株,其中5株针对HA蛋白(3F3、4D7、4F6、10G9、16D6),9株针对NA蛋白(1D4、6H10、6G7、12A2、2E6、2E2、6C7、12F12、12A2)。间接ELISA结果显示,5株HA单抗腹水效价均为1:1 000 000,9株NA单抗腹水效价在1:4 000～1:256 000之间;IPMA结果结果显示,5株HA单抗仅与H7亚型AIV反应,9株NA单抗仅与N9亚型AIV反应,不与其他亚型流感病毒发生反应;HI结果显示,5株HA单抗腹水针对H7-Re3抗原株的HI效Neuropathological alterations价为6 log2～12 log2;神经氨酸酶抑制试验结果显示,9株NA单抗的酶活半数抑制浓度在9.77 ng/m L～10 000 ng/m L之间;MDCK细胞微量中和试验结果显示,5株HA单抗均具有中和活性,中和效价在1:4 000～1:16 000之间;9株NA单抗均不具有中和活性。免疫球蛋白亚型鉴定,4株HA单抗的重链Liproxstatin-1核磁为Ig G1,1株HA单抗的重链为Ig G2b,轻链均为κ链;5株NA单抗的重链为Ig M,4株NA单抗的重链为Ig G1,轻链均为κ链。以胶体金分别标记9株NA单抗,通过Dot-blot进行单抗配对筛选,选择单抗12F12为金标抗体,单抗12A2为拦截抗体;通过优化试纸参数,分别以1 mg/m L单抗12A2和0.5mg/m L金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)在硝酸纤维素膜喷点检测线(T)和质控线(C),成功制备了N9亚型AIV胶体金检测试纸条,建立了N9亚型AIV抗原快速检测方法。特异性鉴定结果显示,试纸条可特异性识别N9亚型AIV,且与H1N1、H9N2、H6N6、H10N7、新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、马立克氏病病毒(MDV)无交叉,表明该试纸具有良好的特异性;敏感性测定结果显示ZD1839说明书,试纸条对H7N9亚型AIV尿囊液的检测限为1 000 TCID_(50),比HA试验高2～4个血凝单位,表明该试纸具有良好的敏感性;广谱性鉴定结果显示,该试纸不仅可以识别2020年和2021年H7N9亚型AIV分离株,且可以识别用于H7N9亚型AIV灭活疫苗的H7-Re1、H7-Re2、H7-Re3、H7-Re4株,表明该试纸具有良好的广谱性;稳定性测试结果显示,经干燥包装后的试纸条,室温保存6个月后,其敏感性、特异性均未发生变化,表明该试纸具有良好的稳定性。综上,本研究成功制备了一种可靠、便捷、快速的N9亚型AIV胶体金检测试纸条,为N9亚型禽流感疫情的监测与诊断提供技术手段。