因炎症、创伤、肿瘤等疾病导致的骨软骨缺损在临床工作中较为常见,由此而导致的肿胀、疼痛、功能障碍等严重影响着人们的生活质量。软骨一旦受损后其自我修复和再生能力极其有限,新生软骨无法与病变的软骨下骨进行整合,骨关节炎时的炎症微环境进一步阻碍了骨软骨的修复。传统的物理、药物和手术治疗对骨软骨缺损的治疗效果均不理想,组织工程与再生医学的出现为骨软骨缺损的修复带来了新的契机。目前,组织工程技术主要通过在支架中负载各种生长因子来提高骨软骨修复再生的效果。但常用的生长因子都有着不可忽视的缺点,如骨形态发生蛋白可导致异位成骨等其他副作用;转化生长因子-β能够干扰软骨下骨的稳态,甚至导致骨关节炎的发生;成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子等也都存在着一些负面作用,如导致软骨钙化等。鉴于以上原因,美国食品药品监督管理局越来越反对此类生长因子的使用,此类生物制剂的审查变的越发严格,这使得它们的商业可行性变得更加困难和昂贵,因此寻找一种能够同时促进软骨及软骨下骨修复再生的药物尤为重要。镁是人体必需的一种常量元素,它在骨骼发育和代谢中发挥着重要的作用,它既可通过调节骨代谢相关的激素、生长因子和多种信号通路来促进成骨分化作用,也可直接作用于骨组织本身从而影响骨骼的矿化过程,它是骨生长的必需元素。还有研究发现,镁具有软骨保护作用,在骨关节炎时,补充镁可以减少Ⅱ型胶原及糖胺聚糖的丢失;啮齿动物中镁的缺乏会引起关节软骨细胞数量和大小的明显减少,蛋白多糖和SOX9水平降低。因此,我们试图将镁的这种既能促进骨修复又能促进软骨修复的双重生物学活性作用应用到骨软骨缺损的修复再生中,以试图弥补传统生长因子的副作用大、制备保存运输困难、价格昂贵等不足之处。第二章中,我们使用不同浓度的Mg~(2+)分别作用于软骨细胞及MC3T3-E1细胞。我们首先分别使用CCK-8及结晶紫染色、活死细胞染色、FITC-鬼笔环肽/DAPI染色评估了不同浓度的Mg~(2+)对软骨细胞及MC3T3-E1细胞增殖、活性及形态的影响;然后我们使用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-q PCR)技术评估了不同浓度的Mg~(2+)对软骨细胞表型维持、肥大分化、去分化及炎症相关基因表达的影响;最后我们使用RT-q PCR技术、ALP定量及显色、茜素红染色评估了不同浓度的Mg~(2+)对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响。结果发现:(1)10 m M及以下的Mg~(2+)促进软骨细胞的增殖,20 m M及以上的Mg~(2+)抑制软骨细胞的增殖,15 m M及以下的Mg~(2+)促进MC3T3-E1的增殖,60 m M及以上的Mg~(2+)抑制MC3T3-E1的增殖;(2)12.5～17.5 m M的Mg~(2+)促进软骨细胞SOX9、COLⅡ及AGC基因的表达,有利于维持软骨细胞表型,7.5～10 m M的Mg~(Alpelisib价格2+)促进软骨细胞COLⅩ基因的表达,有利于软骨细胞肥大分化,Mg~(2+)能够促进软骨细胞COLⅠ基因的表达,不能抑制软骨细胞体外二维培养时发生的去分化;(3)7.5m M的Mg~(2+)抑制炎症软骨细胞IL-1β、MMP13、ADAMTS5基因的表达,有利于抑制软骨细胞的分解代谢,17.5 m M的Mg~(2+)促进炎症软骨细胞TIMP3、HIF-1α基因的表达,有利于促进软骨细胞的合成代谢;(4)5～10 m M的Mg~(2+)能够促进MC3T3-E1细胞RUNX2、ALP、COLⅠ和OCN基因的表达、促进ALP活性及钙结节的形成,有利于MC3T3-E1细胞的成骨分化。在这部分实验中,我们发现不同浓度的Mg~(2+)有利于软骨细胞表型的维持、促进软骨细胞肥大分化、促进MC3T3-E1细胞成骨分化,可能有利于非钙化透明软骨、钙化软骨及软骨下骨的形成,Gel Imaging Systems这为镁应用于骨软骨组织工程支架的设计提供了理论依据。第三章中,我们首先采用溶胶凝胶法合成了不同镁含量的生物活性玻璃(BG、BG-5Mg、BG-10Mg、BG-15Mg),并对它们进行了扫描电镜、透射电镜、XRD、FTIR、XPS、ICP-OES表征;使用CCK-8法筛选各组材料安全浓度的浸提液;然后使用划痕实验及Transwell实验、RT-q PCR技术、Hoechst 33258及DMMB定量技术来评估各组材料对软骨细胞迁移、软骨细胞相关基因(表型维持、肥大分化、去分化、炎症)的表达、DNA及糖胺聚糖合成的影响;还使用RT-q PCR技术、ALP活性定量及显色、茜素红染色来评估各组材料对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响;最后使用三维打印技术制备BG获悉更多、BG-10Mg支架并检测其细胞相容性。结果发现:(1)我们成功合成了不同镁含量的生物活性玻璃。(2)100 mg/m L的BG、BG-5Mg、BG-10Mg、BG-15Mg浸提液相对有利于软骨细胞及MC3T3-E1细胞的增殖;(3)Mg~(2+)能够促进软骨细胞体外迁移,BG不能促进软骨细胞体外迁移,在BG中掺入镁后能促进软骨细胞体外迁移;(4)BG-10Mg、BG-15Mg促进软骨细胞SOX9、COLⅡ、AGC基因表达及糖胺聚糖合成的效果最好,BG-5Mg、BG-10Mg促进COLⅩ基因的表达的效果最好;(5)BG-10Mg能够同时抑制炎症软骨细胞IL-1β、TNF-α、MMP13基因的表达,且对ADAMTS5基因表达无促进作用,它对炎症软骨细胞分解代谢相关基因的综合抑制效果相对最好,但是它还能抑制炎症软骨细胞合成代谢基因TIMP3的表达;(6)BG、BG-5Mg、BG-10Mg、BG-15Mg均能促MC3T3-E1细胞成骨分化相关基因的表达,BG-10Mg最有利于促进MC3T3-E1细胞ALP活性,BG-5Mg最有利于促进MC3T3-E1细胞钙结节的形成,但当BG中的Mg的含量越高时,对钙结节形成的抑制作用越强;(7)三维打印的BG及BG-10Mg支架都具有良好的细胞相容性。上述实验结果表明,BG-10Mg对软骨细胞迁移、软骨细胞外基质合成、软骨细胞肥大分化、MC3T3-E1细胞成骨分化均有一定的促进作用,三维打印的BG-10Mg组织工程支架可尝试用于动物体内修复骨软骨缺损。第四章中,我们建立兔膝关节骨软骨缺损模型,分别植入三维打印BG及BG-10Mg支架,旨在通过镁促进软骨细胞的迁移并合成软骨特异性细胞外基质以及促进骨基质的合成来促进骨软骨缺损的修复再生。术后8周及12周分别取材。首先采用Micro-CT检测各组软骨下骨修复情况,然后采用HE染色、番红O-固绿染色、免疫组化染色检测各组软骨及软骨下骨修复再生情况。结果发现:(1)BG-10Mg组修复骨软骨缺损的效果最好,新生骨软骨结构完整,含有大量的蛋白聚糖,Ⅰ型胶原表达量最少;(2)BG-10Mg组再生的骨软骨组织中,潮线结构清晰,可见非钙化透明软骨、钙化软骨、软骨下骨,而空白对照组及BG组均没有形成层次结构清晰的骨软骨单元;(3)空白对照组、BG组及BG-10Mg组中,缺损周围正常组织中的软骨细胞均不能明显的向缺损区域迁移,新生软骨和周围正常软骨的整合效果欠佳,但仍以BG-10Mg组整合效果相对最好;(4)支架的植入对邻近的生长板软骨结构未见不良影响。上述结果表明,BG-10Mg支架可以更好的促进骨软骨缺损的一体化修复,但不能明显的促进软骨细胞在体内迁移,BG-10Mg支架促进缺损区软骨修复的细胞可能为从软骨下骨中迁移而来的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)并分化为软骨细胞从而完成修复,镁可能在调控兔BMSCs分化为软骨细胞及肥大软骨细胞的过程中起着一定的作用。第五章中,我们进一步验证镁调控兔BMSCs分化为软骨细胞及肥大软骨细胞的作用机制。我们首先使用镁离子荧光探针检测了不同浓度的外源性Mg~(2+)对BMSCs细胞质内Mg~(2+)浓度的影响;然后通过RT-q PCR、Western blot、HE染色、阿尔新蓝-核固红染色、番红O-固绿染色、免疫组化染色检测不同浓度的Mg~(2+)对三维培养的BMSCs分化为软骨细胞及肥大软骨细胞相关标志性基因及蛋白表达的影响;最后通过转录组测序技术分析了Mg~(2+)调控BMSCs分化为软骨细胞的分子机制。结果发现:(1)BMSCs细胞质内Mg~(2+)浓度与外源性Mg~(2+)浓度呈正相关;(2)高浓度的Mg~(2+)(10～15 m M)更有利于BMSCs分化为软骨细胞,而低浓度的Mg~(2+)(5～10 m M)更有利于BMSCs分化为肥大软骨细胞;(3)Mg~(2+)可能是通过激活MAPK信号通路来调控BMSCs分化为软骨细胞。上述结果表明镁在兔BMSCs分化为软骨细胞及肥大软骨细胞的过程中发挥着重要的作用。综上,我们发现了不同浓度的Mg~(2+)有利于软骨细胞表型的维持、促进软骨细胞肥大分化、促进MC3T3-E1细胞成骨分化;BG-10Mg材料对软骨细胞迁移、软骨细胞外基质合成、软骨细胞肥大分化、MC3T3-E1细胞成骨分化的促进作用综合效果最好;BG-10Mg支架具有良好的细胞相容性,能够较好的实现骨软骨缺损的一体化修复;BG-10Mg支架修复骨软骨缺损潜在的机制可能是高浓度的Mg~(2+)促进BMSCs向软骨细胞分化,低浓度的Mg~(2+)促进BMSCs向肥大软骨细胞及成骨细胞分化,从而分别形成非钙化软骨、钙化软骨及软骨下骨,进而形成结构完整的骨软骨单元;Mg~(2+)可能是通过激活MAPK信号通路来调控BMSCs分化为软骨细胞。