1.1实验动物
8 周大雄性 C57BL6/J 小鼠，购自于上海斯泰克实验动物中心。 所有动物实验均严格按照浙江工商大学实验动物保护和使用委员会规定， 并遵循中国实验动物的护理和使用指南。
1.2试剂与仪器
无 Ca2+、Mg2+磷酸盐缓冲液（DPBS），吉诺生物技术有限公司；Matrigel 基质 （CB40230C）， 美国Corning 公司；1 mol/L HEPES 缓冲液（15630080）、DMEM/F12 培养 基 （11320-033）、青 霉 素/链霉 素溶液 （15140-122）、B27 添加剂 （17504044）、N-2添 加 剂 （17502048）、Glutamix 添 加 剂 （35050 – 061）， 美国 Gibco Thermo Fisher Scientific 公司；人类重组 EGF（315-09），美国 Peprotech 公司；Y- 2763 PD03259012 二盐酸盐（Y0503）、N-乙酰基-L-半胱氨酸（A7250）， 美国 Sigma Aldrich 公司；R-spondin 条件培养基 （来自于 R-spondin 细胞系），Dr. Jeffery Wittsett 实验室；Noggin 条件培养基（来自于 HEK- 293 Noggin 细胞），Dr. Peihua Jiang 实验室；细胞回收液（354253），美国 Corning 公司；RNA 抽提试剂 盒 （12-183-018A）， 美 国 Invitrogen Thermo Fisher Scientific 公司 ；VILO 预 混 液 （11755050）、PCR 试 剂 盒 （13001013）， 美 国 Thermo Fisher Scientific 公 司 ；4% 多 聚 甲 醛 （BL539A），Biosharp兰杰柯科技有限公司； SuperBlock 封闭缓冲 液（37515），美国 Thermo Fisher Scientific 公司；OCT包埋剂（4583），美国 Sakura Finetek 公司；封片剂（F6182），美国 Sigma Aldrich 公司。 本试验所用抗体信息见表 1。
SP8 激光共聚焦显微镜、DMI8 倒置荧光显微镜， 德国徕卡公司；Herace VOPS 250i 二氧化碳培养箱、T100PCR 仪，Thermo 公司；L550 低温离心机，湘仪公司；YCTS-103H 回旋式摇床，上海捷呈实验仪器有限公司。
1.3试验方法
1.3.1小肠隐窝分离 8~10 周 大 雄 性 C57BL/6小鼠 CO2 处死， 腹部剖开获得完整小肠放于 4 ℃预冷的 DPBS 溶液中； 去除小肠外壁连接组织后
将小肠纵向剖开，冷 DPBS 清洗后将小肠按照图 1所示分成十二指肠，空肠，回肠 3 份取 3~4 cm，眼科剪将各段小肠剪成 3~5 mm 小段置于 15 mL 离心管中冷 DPBS 清洗至上清澄清； 随后弃上清加入 5 mmol/L EDTA 溶液，摇床 37 ℃，250 r/min 振荡 10 min；消化后 DPBS 清洗组织一次，弃上清，加入适量 DPBS 振荡 20~30 次， 自然沉降后将上清过 100 μm 细胞筛转移至新离心管中，可重复上述振荡收集步骤 1 次， 合并上清； 将收集上清250×g，4 ℃离心 10 min，去除上清，沉淀中加入少量冷基础培养基 【含 1% 谷氨酰胺、1% HEPES、1% 青霉素/链霉素的 DMEM/F12 培养基】， 取 10 μL 计数隐窝数量，根据孔板接种数量调整隐窝浓度。
1.3.2隐窝培养及肠类器官传代 按照 24 孔培养板每孔 50 μL 剂量向分离肠道隐窝中加入相应的体积 Matrigel 基质，轻轻吹打形成均匀悬液。 将悬液接种于 37 ℃提前预热 24 孔板中， 后将培养板置于 37 ℃ CO2 培养箱 30 min，最后向每孔中加入 500 μL 完全培养基【85%~87%基础培养基、3% ~5% R-spondin 条件培养基、10% Noggin 条件培养 基 、 1xB27 （ % ）、 1xN2 （ % ）、 50 ng/ml EGF ，1 mmol/L N-acetylcysteine，10 μmol/L Y-27632）】，每 2 d 更换一次完全培养基。倒置显微镜及 Leica CCD 每天观察和记录隐窝形态变化及生长情况。接种 4~6 d 后小肠类器官可用于传代， 传代时去除点击此处培养基，每孔加 500 μL 冷 DPBS，反复吹打 60~ 100 次，4 ℃，300×g 离心 5 min， 去除上清并加入相应体积 Matrigel 基质，随后按照前述方法接种、更换培养基及记录类器官生长变化。
1.3.3免疫荧光 培养第 5 d 类器官， 去除培养基后加入 500 μL 冷细胞回收溶液，将培养板置于冰上回转式摇床 40 r/min 振荡 1 h； 后 800 r/min离心机瞬离取沉淀回收类器官；沉淀中加入 4%多聚甲醛室温固定 15 min， 随后 0.01%亚甲基蓝溶液室温孵育 20 min， 离心后沉淀中加入 20%蔗糖溶液 4 ℃过夜； 第 2 天 OCT 包埋剂包埋，Leica 冰冻切片获得类器官冷冻切片，切片厚度 5 μm。 PBS清洗玻片，加入抗原封闭液（含有 2%驴血清、0.3%
Triton X-100 的 SuperBlock 封闭溶液）室温孵 30 min；加入一抗 4 ℃过夜（一抗种类及稀释比例如表 1 所示）；PBS 清洗 3 次（每次 5 min）后加入二抗室温孵育 30 min；PBS 清洗 4 次（每次 5 min）后DAPI 复染， 封片剂封片后 Leica SP8 激光共聚焦显微镜获取图像。 隐窝分离试验获取肠段时，同时取 0.5~1 cm 肠段用于获取冰冻切片， 获取组织4%多聚甲醛 4 ℃固定 2 h，PBS 清洗组织 3 次 （每次 5 min），后续冰冻切片获取、免疫荧光及图像获取方法与类器官相同。E7080分子式
1.3.4RT-PCR 传代培养 5~6 d 小肠类器官，去除培养基后加入 500 μL 冷细胞回收溶液，将培养板置于冰上回转式摇床 40 r/min 振荡 1 h； 后 800 r/min 离心机瞬离取沉淀回收类器官。 类器官和肠道组织通过 RNA 抽提试剂盒获取 RNA，VILO 合成 cDNA，PCR 试剂盒获得目标产物，琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 结果， 基因测序确定序列正确性。PCR 所用引物如表 2 所示。