研究背景:随着精准医疗时代的来临,基于现代精准治疗的理念,将治疗药物靶向性的输送至病变组织,提高药物对病变组织的选择性,减少甚至避免药物的毒副作用以及对微生态平衡的破坏,是近年来药物研究的热点。多肽广泛存在于自然界的生物体内,如激素、神经递质、生长因子、离子通道配体和免疫防御因子等,在生物体的生理学中发挥重要作用。随着多肽固相合成法的发明及纯化技术的提高,人工合成功能性多肽的研究越来越多,如将多肽作为药物载体、抗菌肽、靶向肽、细胞穿透肽等多种功能形式。本论文以感染性疾病和肿瘤的特性为研究对象,进行靶向性多肽药物的设计和研究,以期获得具有临床应用潜能的肽类药物。研究方法:1.以Fmoc保护氨基酸为原料,通过固相合成法分别合成靶向肽CP7和广谱抗菌FP3-1和FP3-2等肽类化合物,并经加成、环化等手段将这些片段连接,构成复杂的功能性多肽CP7-FP13-1和CP7-FP13-2。粗品经凝胶柱色谱结合制备液相色谱法纯化后,再经高效液相色谱法检测它们的纯度及电喷雾电离质谱确定分子量。2.通过测定最小抑菌浓度和最小杀菌浓度等方法确定复合肽的抗菌活性。3.通过qRT-PCR、溶血实验等手段验证复合肽对S.aureus的毒力因子的抑制作用。4.通过平板菌落技术法检测抗菌复合肽的杀菌速率。5.通过MTT法检测复合肽对RAW 264.7的细胞毒性。6.通过棋盘法检测复合肽与抗生素联合治疗S.aureus作用。7.合成AgrC-Ⅰ蛋白的不同胞外域,通过等温量热滴定法初步探讨CP7、CP7-FP13-2与AgrC-Ⅰ跨膜蛋白的相互作用及可能的结合区域。8.通过酶标仪检测法、结晶紫染色法、活死细菌染色法等多种手段检测多肽对S.aureus生物膜的抑制作用。9.通过色氨酸荧光光谱法检测FP13-2、CP7-FP13-2与S.aureus细胞膜的相互作用。10.通过紫外分光光度计检测核酸吸光度,流式细胞术检测碘化丙啶荧光强度,进一步探讨所合成多肽的抗菌机制。11.构建S.aureus感染小鼠模型,验证复合肽在小鼠体内的抗菌活性。12.通过固相合成法合成酸激发抗菌肽P12,并通过酰胺化反应与光敏剂PpⅨ偶联,构建靶向性酸激活的新型光敏剂PpⅨ-P12。13.通过测定最小抑菌浓度和最小杀菌浓度等方法确定P3-Methyladenine试剂12在不同pH培养基中的抗菌活性。14.结晶紫染色法、活死细菌染色法等多种手段检测P12在不同pH微环境下对S.mutans生物膜的抑制作用。15.通过平板菌落计数法检测由PpⅨ-P12介导的光毒力治疗在不同pH培养基中的杀菌效果。16.荧光显微镜下观察P12在不同pH环境下与HT-29细胞的结合力。17.MTT法检测检测PpⅨ-P12的毒性以及在不同pH下的光毒性。18.流式细胞术检测PpⅨ-P12的光照下的活性氧产量,探讨可能的作用机制。19.流式细胞术检测PpⅨ-P12在光照下在不同pH值下对HT-29细胞凋亡的影响。实验结果:1.以天然AIP-Ⅲ为原型化合物,对其进行结构改造,合成了靶向S.aureus agr系统的环形多肽CP7。通过合理设计、合成和活性筛选,得到FP13-1和FP13-2高效广谱抗菌肽,并分别与CP7连接,成功构建复合肽和CP7-FP13-1和CP7-FP13-2。经初步筛选,CP7-FP13-2抗菌活性更好,因此以其为主要化合物开展后续研究。2.CP7、CP7-FP13-2可以靶向S.aureus的agr系统,特异性抑制S.aureus RNAⅢ及毒力因子hla、psm-α表达,且可抑制S.aureus的溶血作用和生物膜形成。3.CP7-FP13-2对S.aureus的杀菌速率明显快于FP13-2,且对MRSA仍然有高效的抗菌作用。4.CP7、CP7-FP13-2 与 AgrC-Ⅰ跨膜蛋白的 extra-loops-Ⅱ 结合力最强。5.CP7-FP13-2可以破坏细菌膜的完整性,导致细菌内容物泄露,从而发挥抗菌作用。6.体内实验表明,CP7-FP13-2可以显著提高S.aureus感染小鼠的生存率、延长小鼠存活时间。7.成功设计合成酸激活抗菌肽P12,并将P12作为载体成功构建靶向酸性微环境的新型光敏剂PpⅨ-P12。8.酸性微环境下可以激活P1Translational Research2的抗菌活性,并可激活其抑制S.mutans生物膜的能力。9.PpⅨ-P12在酸性微环境下可以显著增强其光动力抗菌、抗肿瘤活性。10.由PpⅨ-P12介导的光动力治疗在酸性微环境下可以增加HT-29细胞内活性氧产量,增强促细胞凋亡的能力。研究结论:1.本研究中,我们以天然AIP-Ⅲ为模板,设计合成了靶向S.aureus agr系统的环形多肽CP7。通过合理设计合成了高效广谱抗菌FP13-2,并将其与CP7连接,成功合成了具有高效抗菌且可特异性抑制S.aureus毒力因子双重作用的复合肽CP7-FP13-2。该肽具有较低的细胞毒性,靶向S.aureus agr系统LGK-974采购,能在极低浓度(小于MIC)下抑制S.aureus多种毒力因子的表达,且抗菌活性高,能有效杀灭包括MRSA在内的多种细菌。2.通过合理设计,我们成功构建了具有酸激活抗菌作用的多肽P12,并将其作为载体与光敏剂PpⅨ连接构建新型的具有酸激发靶向性的光敏剂PpⅨ-P12,由其介导的光动力治疗在酸性微环境下可以显著增强其光动力抗菌、抗肿瘤活性。