目的:本研究采用结扎大鼠左冠状动脉前降支造成心肌梗死后形成慢性心力衰竭(CHF)模型,进行加参方治疗CHF的药效学研究,在此基础上,基于超高效液相色谱-飞行时间质谱联用技术(UPLC-Q-TOF-MS)技术对加参方治疗CHF的血中移行成分进行分析,进一步揭示加参方治疗CHF的药效物质基础;利用代谢组学技术对CHF大鼠血清及尿液中的代谢物进行分析,寻找CHF发生的代谢标志物,并构建加参方治疗CHF的代谢通路,以期从代谢物组阐释加参方对CHF的影响;最后对加参方治疗CHF的血中移行成分和代谢标志物进行相关性分析,进一步分析加参方治疗CHF的作用机制,为加参方临床用药提供依据。方法:1.加参方治疗CHF的药效学研究采用结扎SD雄性大鼠左冠状动脉前降支5周后造成CHF模型,根据EF值和体重分为4组,包括空白对照组(Con)、假手术组(Sham)、模型组(CHF)和加参方组(6g/kg生药量,JSF),每组9-10只,连续给药4周,ELISA法检测心肌组织N-末端脑利钠肽原(NT-pro BNP)水平、超声检测心脏结构和功能、HE染色检测心肌病理变化、Masson染色检测心肌纤维化、Western-Blot法检测纤维化相关蛋白(TGF-β1、Smad2/3、ColⅠ、ColⅢ、MMP2、MMP9和TIMP1)的表达。2.加参方治疗CHF的血中移行成分研究在加参方治疗CHF的药效基础上,采用UPLC-Q-TOF-MS技术对模型组和加参方组大鼠眼眶血清中的移行成分进行检测,利用Agilent Mass Hunter分析软件进行数据处理,通过对比模型组血清和加参方组血清样品的色谱和质谱信息,区分提取吸收入血原型药物成分及其代谢产物的离子信号,结合文献中的加参方体外化学成分和生理状态大鼠入血成分,并对比保留时间(t _R)、相对分子质量、分子式、质荷比(m/z)和二级碎片离子等信息对化合物进行鉴定,分析CHF模型基础上的入血原型成分及代谢产物。3.基于代谢组学技术的加参方治疗CHF的作用机制研究在加参方治疗CHF的药效基础上,采用UPLC-Q-TOF-MS技术对假手术组、模型组和加参方组大鼠血清和尿液中小分子代谢物进行检测,利用Waters Mass Lynx软件、Excel等进行数据预处理;采用SIMCA软件进行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)筛选差异代谢物;利用HMDB代谢物数据平台鉴定分析CHF发生及加参方干预后大鼠体内的代谢标志物;采用Metabo Analyst代谢组学分析平台构建代谢通algal bioengineering路。最后采用皮尔逊相关法对加参方治疗CHF的血中移行成分和代谢标志物进行相关性分析。结果:1.加参方治疗CHF的药效学研究(1)加参方对CHF大鼠一般情况的影响空白对照组和假手术组大鼠反应敏捷,行动迅速,精神状态良好。与假手术组比较,模型组大鼠造模后出现明显的脸部肿胀,反应迟钝,行动迟缓,出现拱背等症状,抓取时反抗程度轻。与模型组比较,加参方组大鼠给药后上述症状有所改善。(2)加参方对CHF大鼠心脏结构的影响与假手术组比较,模型组左室舒张末期内径(LVID;d)和左室收缩末期内径(LVID;s)明显升高(P<0.05,P<0.01),收缩末期室间隔厚度(IVS;s)显著降低(P<0.01),舒张末期室间隔厚度(IVS;d)、左室舒张末期后壁厚度(LVPW;d)和左室收缩末期后壁厚度(LVPW;s)有降低趋势(P>0.05)。给药后,与模型组比较,加参方组LVPW;s明显升高(P<0.05),LVID;d与LVID;s有降低趋势(P>0.05),IVS;d、IVS;s和LVPW;d有升高趋势(P>0.05)。(3)加参方对CHF大鼠心脏功能的影响与假手术组比较,模型组射血分数(EF)与短轴缩短率(FS)均显著降低(P<0.01),左室舒张末期容积(LV Vol d)与左室收缩末期容积(LV Vol s)均明显升高(P<0.05);给药后,与模型组比较,加参方组EF与FS值显著升高(P<0.01),LV Vol d和LV Vol s有降低趋势(P>0.05)。(4)加参方对CHF大鼠心肌病理损伤的影响心肌组织经HE染色,空白对照组与假手术组大鼠心肌细胞完整、排列整齐、着色均匀,细胞核、细胞浆完整,无炎性细胞浸润。模型组大鼠可见左心室腔扩大(全心横切面),出现明显的梗死灶,肌纤维排列紊乱,纤维细胞增多,心肌细胞减少、排列紊乱、细胞间质水肿,梗死灶及周围可见炎性细胞浸润。与模型组比较,加参方组大鼠心室腔相对缩小,梗死灶相对减小,上述现象减轻。(5)加参方对CHF大鼠心肌纤维化的影响心肌组织经Masson染色,空白对照组和假手术组大鼠心肌细胞间隙有少量胶原纤维,心肌细胞结构形态正常。模型组大鼠左心室前壁可见大量胶原纤维,呈片MLN4924抑制剂状分布,纤维可见明显肿胀、断裂,胶原纤维间有残存的心肌细胞。与模型组比较,加参方组大鼠胶原纤维面积缩小,胶原纤维间可见排列较整齐的心肌细胞。与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织CVF明显升高(P<0.05);与模型组比较,加参方组大鼠心肌组织胶原容积分数(CVF)无明显降低(P>0.05)。(6)加参方对CHF大鼠心肌组织NT-pro BNP含量的影响与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织NT-pro BNP含量显著升高(P<0.01);与模型组比较,加参方组心肌组织NT-pro BNP明显降低(P<0.05)。(7)加参方对CHF大鼠心肌组织TGF-β1/Smad纤维化通路相关蛋白表达的影响与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2/3、ColⅠ、ColⅢ、MMP2蛋白表达和MMP2/TIMP1比例显著升高(P<0.01),ColⅠ/ColⅢ比例明显升高(P<0.05),MMP9和TIMP1蛋白表达显著降低(P<0.01);给药后,与模型组比较,加参方组大鼠心肌组织TGF-β1、Smad2/3、ColⅠ、ColⅢ、MMP2和MMP2/TIMP1蛋白表达显著降低(P<0.01),ColⅠ/ColⅢ蛋白表达明显降低(P<0.05),MMP9蛋白表达明显升高(P<0.05),TIMP1蛋白表达有升高趋势(P>0.05)。2.加参方治疗CHF的血中移行成分研究与模型组比较,在加参方组大鼠血清中共鉴定出11个血中移行成分,均为原型成分,多为水溶性,主要来源于黄芪、丹参、香加皮、益母草,包括酚酸类、黄酮类、生物碱类和糖类,分别为盐酸水苏碱、蔗糖、柠檬酸、丹参素、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、紫草酸、芒柄花苷、东莨菪内酯、4-甲氧基水杨酸。3.基于代谢组学技术的加参方治疗CHF的作用机制研究(1)血清代谢组学分析血清代谢组学的方法学考察结果显示,仪器精密度,方法精密度和样品稳定性峰面积的RSD<30%的比例均大于70%,说明仪器和样本稳定,方法可靠。与假手术组比较,模型组共得到33个与CHF相关的代谢标志物;与模型组比较,加参方组21个代谢物有回调趋势,其中9个代谢物有明显差异,分别为单酰基甘油酯((14:1)、(14:0)、(16:0)、(18:0))、5'-羧基-α-生育酚、甘油二酯(16:0/16:1)、α-亚麻基肉碱、溶血磷脂((20:1))和乳糖神经酰胺(d18:1/22:0),主要干预甘油磷脂代谢通路、鞘脂代谢通路及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路。(2)尿液代谢组学分析尿液代谢组学的方法学考察的结果显示,仪器精密度,方法精密度和样品稳定性峰面积的RSD<30%的比例均大于70%,说明仪器和样本稳定,方法可靠。与假手术组比较,模型组共得到38个与CHF相关的代谢标志物,与模型组比较,加参方组29个代谢物有回调趋势,其中4个代谢物有明显差异,分别为精氨酸赖氨酸、3-氧十四烷酸、3-羟基十四烷二酸和3-甲基组氨酸,主要干预泛酸和Co A生物合成通路、嘌呤代谢通路及组氨酸代谢通路。(3)加参方治疗CHF的血中移行成分与代谢标志物相关性分析经Pearson相关系数分析,咖啡酸与3-羟基十四烷二酸、精氨酸-赖氨酸显著正相关,与3-甲基组氨酸显著负相关;4-甲氧基水杨酸与单酰基甘油酯(18:0)显著负相关,与乳糖神经酰胺(d18:1/22:0)显著正相关;盐酸水苏碱与精氨酸-赖氨酸显著负相关;α-亚麻基肉碱与丹参素和绿原酸显著正相关,与蔗糖成显著负相关;柠檬酸与溶血磷脂(20:1)显著正相关。结论:1.加参方通过降低CHF大鼠心肌组织NT-pro BNP水平,增加CHF大鼠LVPW;s,升高CHF大鼠EF和FS值,减轻CHF大鼠心肌病理损伤和心肌纤维化,改善CHF。加参方下调心肌组织TGF-β1、Smad2/3、ColⅠ、ColⅢ、MMP2蛋白表达及ColⅠ/ColⅢ比例,上调MMP9蛋白表达及MMP2/TIMP1比例,抑制TGF-β1HIF抑制剂/Smad心肌纤维化通路,改善CHF大鼠心肌纤维化,可能是加参方改善CHF的作用机制之一。2.加参方治疗CHF的血中移行成分多为水溶性成分,主要为黄芪、丹参、香加皮、益母草中相关成分,包括酚酸类、黄酮类、生物碱类和糖类,是加参方改善CHF可能的药效物质基础。3.加参方对CHF大鼠血清代谢标志物的调节作用可能与甘油磷脂代谢通路、鞘脂代谢通路及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路相关;对CHF大鼠尿液代谢标志物的调节作用可能与泛酸和Co A生物合成通路、嘌呤代谢通路及组氨酸代谢通路相关。说明加参方可能通过以上代谢通路改善CHF。4.加参方治疗CHF的血中移行成分中酚酸类与其治疗CHF的氨基酸代谢通路密切相关。说明通过抑制氧化应激和内皮损伤,减轻心肌纤维化,减缓心肌重构,可能是加参方改善CHF的机制之一。