目的1.通过3T3-L1与TCMK-1细胞的共培养系统验证DN的发生机制。2.验证GSY干预脂肪细胞外泌体中的miRNA-21-5p对DN的作用机制。3.GSY对来源于脂肪细胞的miRNA-21-5p及糖脂代谢的干预研究。方法(1)TCMK-1细胞,建立高糖模型,分空白组(NC)、IR模型组(MOD)、甘松饮低中高剂量组,CCK8测TCMK-1细胞活力,流式仪检测周期和凋亡水平,Western blot法和q RT-PCR法用于检测核心蛋白含量及基因的表达。(2)诱导3T3-L1前脂肪细胞;建立IR模型,检测IR模型的稳定性。3T3-L3脂肪细胞与TCMK-1细胞建立共培养体系,建立IR模型,计算葡萄糖消耗量,检测IR模型的稳定性。脂肪细胞与共Rapamycin抑制剂培养体系,同时设空白组(NC)、IR模型组(MOD)、甘松饮组(GSY-H),油红O检测脂滴变化,GOD-POD法检测葡萄糖消耗量和甘油三酯的含量,Western blot法和q RT-PCR法检测核心蛋白含量及基因的表达。(3)差速离心法提取共培养体系上清中的Exo,TEX观察Exo形态,NTA检测Exo粒径和浓度,Western blot法和q RT-PCR法检测相关蛋白含量及基因的表达。共培养体系分空白组(NC)、IR模型组(MOD)、甘松饮低中高剂量组,CCK-8检测TCMK-1细胞活力,流式仪检测周期和凋亡水平,Western blot法和q RT-PCR法检测核心蛋白含量及基因的表达。结果(1)GSY干预TCMK-1细胞,同MOD比较,GSY使TCMK-1细胞活力下降(P<0.01),细胞凋亡呈剂量依耐性减少(P<0.01);细胞周期阻滞在G0/G1期和S期。Western blot结果:GSY能够上调IR状态下SMAD7、p-SMAD2、p-SMAD3和p-SMAD7蛋白表达,下调TGF-β1、SMAD2及SMAD3蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。q RT-PCR结果:GSY上调IR状态下的TGF-β1、SMAD2、SMAD3及SMAD7基因immune tissue的表达(P<0.05或P<0.01)。(2)诱导结果:“戒环”状脂滴染为红色;脂肪细胞48h的IR模型具有稳定性,共培养体系48h的IR模型具有稳定性(P<0.01);脂肪细胞与共培养体系结果:同MOD组比,GSY干预后脂滴分解增加,葡萄糖消耗量增多(P<0.01);脂肪细胞TG含量增多,共培养体系TG含量减少(P<0.01)。Western blot结果:与MOD组比,GSY能上调IR状态下PPARγ的蛋白表达,下调GLUT4及FABP4蛋白表达(P<0.05或P<0.01);q RT-PCR结果:与MOD组比,脂肪细胞及Exo中GSY组PPARγ、GLUT4及FABP4基因表达升高(P<0.05或P<0.01),共培养体系中,GSY组GLUT4基因表达降低(P<0.05或P<0.01)。(3)Exo在TEM下呈球形小囊泡,Exo粒径是130.2nm,浓度为4.8E+12个/ml。Western blot检测到CD9、CD63和TSG101蛋白的表达。q RZ-IETD-FMK试剂T-PCR检测到PPARγ、GLUT4和FABP4基因的表达;CCK8结果:同MOD比,GSY使TCMK-1细胞活力下降(P<0.01),细胞凋亡呈现剂量依耐性减少(P<0.01);细胞周期阻滞在G0/G1期。Western blot结果:GSY不同程度上调IR状态下SMAD3、SMAD7及p-SMAD2蛋白的表达,下调TGF-β1、SMAD2p-SMAD3和p-SMAD7蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)。q RT-PCR结果显示:GSY上调IR状态下SMAD2基因,下调TGF-β1、SMAD3和SMAD7基因的表达(P<0.05或P<0.01);与MOD组比,GSY干预后,TCMK-1细胞中miRNA-21-5p的表达降低,Exo与TCMK-1细胞中miRNA-21-5p的表达升高(P<0.05或P<0.01)。结论1.GSY对IR状态下小鼠的肾小管上皮细胞具有保护作用。2.GSY通过调控PPARγ、GLUT4及FABP4蛋白表达水平及PPARγ、GLUT4及FABP4基因的表达,改善糖脂代谢。3.GSY通过脂肪细胞分泌的miR-21-5p,调控TFG-β1/SMAD信号通路保护肾小管上皮细胞。