目的:探索黑磷纳米片(Black phosphorus nanosheets,BPNSs)对帕金森病(Parkinson’s diseasSARS-CoV2 virus infectione,PD)中氧化应激水平、线粒体功能变化、细胞自噬和α-突触核蛋白(Alpha-synuclein,α-syn)表达的影响,以及探讨BPNSs通过清除活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和降解帕金森病中聚集的α-syn保护神经元的分子机制。方法:通过透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM)和原子力显微镜(Atomic force microscope,AFM)等技术对BPNSs进行表征分析。将BPNSs-PEG-Cy5干预细胞和尾静脉注射C57小鼠后,荧光观察BPNSs是否能进入细胞并通过血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)。采用6-羟基多巴胺(6-Hydroxydopamine,6-OHDA)诱导PC12细胞、N2线虫和BZ555线虫建立PD模型,并将其分为Control组、6-OHDA组、BPNSs+6-OHDA组;采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氢吡啶(1-methy-4-pheny1-1,2,3,6-tetrahydropyidine,MPTP)诱导C57小鼠建立PD小鼠模型,将其分为Control组、MPTP组、BPNSs组、BPNSs+MPTP组。1.细胞实验:噻唑蓝(Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT)检测PC12细胞活性,筛选6-OHDA最佳建模浓度及BPNSs最佳干预浓度;硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid,TBA)法检测细胞内丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量的变化;荧光探针染色检测细胞内氧化应激水平及线粒体功能;流式细胞术检测细胞凋亡;TEM检测细胞内线粒体形态变化;western blot检测细胞内TH、NDUFS3、Caspase3、α-syn表达量变化。2.动物实验:(1)线虫实验:通过检测线虫寿命及多巴胺依赖行为确定BPNSs最佳干预浓度;Dihydroethidium探针染色检测线虫体内氧化应激水平;激光共聚焦检测NL5901线虫体内α-syn荧光强度的变化,BZ555线虫神经元形态变化。(2)C57小鼠实selleckchem Taurine验:通过旷场实验、爬杆实验、强迫游泳检测小鼠运动功能,评估BPNSs治疗效果;采用TBA法、微板法及WST-1法,检测小鼠中脑黑质内MDA含量、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活力的变化;western blot检测小鼠中脑内TH、α-syn表达量变化。3.机制研究:(1)直接作用:分子模拟和体外培养α-syn纤维,观察BPNSs作用前后α-syn纤维的变化。(2)间接作用:为了证实BPNSs在调节自噬中的作用,western blot或激光共聚焦检测BPNSs、3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)和氯喹(Chloroquine,CQ)干预前后PD细胞及DA2123线虫自噬水平的变化;为了探讨BPNSs、p62和α-syn之间的关系,western blot检测使用p62活性抑制剂XRK3F2和BPNSs干预前后p62,α-syn蛋白表达量的变化。结果:表征结果显示,BPNSs平均长度为126±10 nm、平均宽度为75±7 nm、平均厚度为4±1 nm、Zeta电位约为-10 m V,综上表明BPNSs被成功制备;BPNSs-PEG-Cy5作用细胞和小鼠,实验结果表明BPNSs可进入细胞穿过小鼠BBB。1.细胞实验结果:MTT结果显示6-OHDA最佳造模浓度是200μmol/L;BPNSs最佳干预浓度是2.5μg/m L。与Control组相比,6-OHDA组氧化应激水平和凋亡率增加;线粒体数量减少,形态肿胀,且线粒体嵴溶解;PC12细胞神经突起变短;TH、NDUFS3表达量降低,Caspase3、α-syn表达量增加。与6-OHDA组相比,BPNSs+6-OHDA组细胞内氧化应激水平和凋亡率降低;线粒体功能恢复;PC12细胞神经突起变长;TH、NDUFS3表达量增加,Caspase3、α-syn表达量降低。2.动物实验结果:(1)线虫实验结果:与ConCL13900半抑制浓度trol组相比,6-OHDA组线虫寿命减短,多巴胺依赖行为障碍,氧化应激水平增加,多巴胺能神经元形态受损;与6-OHDA组相比,BPNSs+6-OHDA组线虫寿命延长,多巴胺依赖行为恢复,氧化应激水平降低,多巴胺能神经元形态恢复;NL5901线虫中,BPNSs干预降低α-syn表达量。(2)C57小鼠实验结果:与Control组相比,MPTP组小鼠行为能力障碍,氧化应激水平增高,TH表达量降低,α-syn表达量增加;与MPTP组相比,BPNSs+MPTP组小鼠行为能力有所改善,氧化应激水平降低,TH表达量降低,α-syn表达量降低。3.机制研究结果:(1)直接作用结果:分子模拟结果、α-syn纤维与BPNSs体外共培养显示BPNSs可与α-syn纤维相互作用并使其降解;(2)自噬降解结果:PD细胞模型中,LC3B表达减少,p62表达增加,BPNSs干预后LC3B表达增多,p62表达减少;DA2123线虫中,单独使用BPNSs,ATG8-GFP增加;与3-MA和CQ共同处理DA2123,ATG8-GFP减少;BPNSs和XRK3F2处理过表达α-syn的细胞后,与过表达α-syn组相比,XRK3F2处理组α-syn表达量较低,BPNSs和XRK3F2共同处理后,p62、α-syn表达量降低。结论:1.BPNSs能够降低氧化应激水平、降低细胞凋亡、改善线粒体功能障碍、降低α-syn蛋白聚集、维护DA能神经元的形态和功能,对PD具有神经保护作用。2.BPNSs能通过范德华力与α-syn纤维直接作用,并改变其二级结构,使其降解。3.BPNSs可下调p62的表达,从而促进自噬的增加,消除异常聚集的α-syn。