目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是导致慢性肾脏疾病和终末期肾脏疾病的主要原因。目前我国糖尿病发病率逐年增加,而糖尿病肾病是糖尿病的重要并发症之一,也是导致糖尿病患者死亡的主要原因。正常情况下足细胞覆盖于肾小球基底膜外侧,并且足细胞的裂孔膜与肾小球基底膜及毛细血管球有孔内皮共同构成肾小球滤过屏障,防止蛋白质大分子滤出。有研究表明,在糖尿病肾病发生发展过程中常伴随足细胞损伤的发生,进而导致足细胞功能障碍甚至功能丧失,从而引起蛋白尿的产生,严重时则会导致足细胞缺失,最终导致肾小球硬化甚至肾衰竭。因此,寻找新靶点来防止蛋白尿的产生以及足细胞的缺失至关重要。细胞焦亡是一种由Gasdermin蛋白家族介导的细胞程序性死亡方式。具有依赖Caspase-1的经典途径和依赖Caspase-4、5、11的非经典途径两种作用方式。已有研究表明,细胞焦亡所依赖的经典途径由NLRP3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)炎症小体介导。在受到损伤刺激后,NLRP3通过结合ASC(apoptosisassociated speck like protein,ASC)招募Pro-caspase-1使其活化,活化的Caspase-1可以切割Gasdermin-D而引起细胞肿胀、细胞核固缩、DNA断裂、细胞膜失去完整性并促进炎症因子IL-1β和IL-18的释放,最终导致细胞焦亡。哺乳动物NIMA相关激酶7(NIMA-related kinase 7,NEK7)是NIMA家族中一个成员,是细胞有丝分裂和DNA损伤应答的重要调节因子,主要分布于大脑、肝脏、肾脏、卵巢、心脏、肌肉组织等部位,其中在肾脏表达量最高。最近研究表明NEK7与NLRP3发挥相互作用,参与NLRP3炎症小体的激活。在本研究中利用糖尿病小鼠以及高糖培养的人足细胞为研究对象进行实验,观察NEK7在糖尿病肾病足细胞焦亡的作用LBH589纯度以及机制,验证NEK7能否成为糖尿病肾病治疗的新靶点。方法:1.明确NEK7在糖尿病肾病足细胞中的表达(1)利用以C57BL/6J为背景的8周龄雄性野生型(Wild-type,WT)小鼠和NEK7基因敲除纯合(NEK7 knockout,NKO)小鼠为研究对象进行以下实验:小鼠于STZ造模成功后16周进行取材,留取部分肾脏组织用于Western blot检测,通过Western blot观察各组小鼠肾组织中NEK7的表达;留取部分肾脏组织用于冰冻切片制备,通过免疫荧光共染色检测NEK7与synaptopodin共定位表达情况。(2)以体外培养的HPCs为研究对象,高糖分别刺激0、6、12、24、48和72 h。Western blot检测NEK7蛋白的表达。2.明确NEK7对糖尿病肾病肾脏形态学变化以及足细胞焦亡的影响(1)动物模型分组同上。小鼠于STZ造模成功后16周进行取材,留取血标本以及24小时尿标本以检测生化指标。留取部分肾脏组织用于石蜡切片制备,通过光镜观察肾脏形态学变化。Western blot检测各组小鼠肾组织中Gasdermin-D的蛋白表达,免疫荧光共染色检测Gasdermin-D与synaptopodin共定位表达情况。(2)以体外培养的HPCs为研究对象,细胞随机分为:正常糖组(5.5mmol/L glucose,NG)、高渗对照组(5.5 mmol/L glucose+24.5mmol/L mannitol,M)、高糖组(30mmol/L glucose,HG)、高糖+Scr组(30mmol/L glucose+Scr,HG+Scr)、高糖+NEK7 si RNA组(30mmol/L glucose+NEK7si RNA,HG+NEK7 si RNA)。各组细胞分别刺激48 h后进行相关指标的检测。Western blot检测NEK7、Gasdermin-D、IL-1β、IL-18的蛋白表达。免疫荧光染色检测NEK7、Gasdermin-D、IL-1β定位。3.明确NLRP3炎症小体对高糖培养的HPCs细胞焦亡的影响利用体外培养的HPCs为研究对象,细胞随机分为:正常糖组(5.5mmol/L glucose,NG)、高渗对照组(5.5 mmol/L glucose+24.5mmol/L mannitol,M)、高糖组(30mmol/L glucose,HG)、高糖+溶剂对照组(30mmol/L glucose+DMSO,HG+DMSO)、高糖+MCC950组(30mmol/L glucose+MCC950,HG+MCC)。各组细胞分别刺激48 h后进行相关指标的检测。Western blot和免疫荧光染色检测NLRP3、Gasdermin-D、Caspase-1、IL-1β的蛋白表达及定位。4.明确高糖培养的HPCs中NEK7与NLRP3的相互作用以体外培养的HPCs为研究对象,细胞培养方法及分组同方法2。通过Western blot和免疫荧光染色检测NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表达及定位。利用免疫荧光共染色检测NEK7和NLRP3的表达以及共定位情况;以及利用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)检测NEK7和NLRP3之间的关系。结果:1.NEK7在糖尿病肾病足细胞中的表达(1)Western bZ-IETD-FMK体外lot以及免疫荧光共染色结果显示:与野生型对照组相比,野生型糖尿病组肾脏中NEK7表达明显增高,并且与synaptopodin共定位表达显著增加;与野生型糖尿病组相比,NEK7基因敲除纯合糖尿组肾脏中未检测到NEK7的表达。(2)Western blot结果表明:在不同时间点下高糖培养的HPCs中,与0h相比NEK7的蛋白表达水平随时间梯度逐渐递增,其中高糖培养48h时,NEK7的蛋白表达水平增高最显著。2.NEK7对糖尿病肾病足细胞焦亡的影响(1)各项血尿生化指标检测结果显示:NKO+STZ组小鼠明显改善了WT+STZ组小鼠的血糖、UAE、Scr、UACR和BUN的高表达。光镜下观察:与野生型对照组相比,野生糖尿病组肾小球体积轻微增大,基质沉积有所增多,肾小球足细胞数量减少。敲除NEK7基因后明显改善上述情况。Western blot以及免疫荧光共染色结果显示:与野生型对照组相比,野生型糖尿病组肾脏中Gasdermin-D的表达明显增高,并且与synaptopodin共定位表达显著增加;与野生型糖尿病组相比,NEK7基因敲除纯合糖尿组肾脏中Gasdermin-D表达显著下降,并且与synaptopodin共定位表达明显降低。(2)Western blot和免Novel coronavirus-infected pneumonia疫荧光检测结果显示:与正常糖组相比,高糖组HPCs中NEK7、Gasdermin-D、IL-1β、IL-18蛋白表达水平显著增加;NEK7 si RNA抑制了以上指标的蛋白表达水平。3.NLRP3炎症小体对高糖培养的HPCs细胞焦亡的影响Western blot和免疫荧光结果说明:与正常糖组相比,高糖组HPCs中NLRP3、Gasdermin-D、Caspase-1、IL-1β蛋白表达水平明显增加;MCC950干预改善了上述情况。4.高糖培养的HPCs中NEK7与NLRP3的相互作用Western blot和免疫荧光检测结果显示:与正常糖组相比,高糖组HPCs中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表达水平明显增加;而NEK7si RNA显著抑制了NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表达。并且通过免疫荧光共染色结果显示:NEK7与NLRP3在同一位置表达。Co-IP结果显示:NEK7与NLRP3之间存在相互作用。结论:糖尿病肾病时NEK7表达上调,并通过激活NLRP3炎症小体参与调控足细胞焦亡,从而导致足细胞缺失,介导糖尿病肾病的发生发展。