研究背景:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,近年来,靶向治疗和免疫疗法已取得了重大的进步,弥补了CRC传统疗法如化疗、放射治疗和手术的缺陷。但由于治疗耐药性和副作用,诊断后只有63%的CRC患者能够存活5年以上,因此,需要开发新的治疗手段用于预防和治疗CRC。大量研究表明,从植物中分离的化学物质对癌症和其他疾病非常有效。胭脂素是一种从胭脂树种子中提取的天然化合物,广泛应用在食品添加剂和着色剂,近年研究表明,胭脂素具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤和抗纤维化等多种药理学作用,但迄今为止,胭脂素是否具有抗CRC的作用以及潜在的分子机制尚未见报道。方法:人类CRC细胞系Ca CO2和SW480细胞,以及正常的人类结肠上皮细胞系HIEC和NCM460培养于含10%胎牛血清的Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM)中。胭脂素溶解于二甲基亚砜(DMSO)中至终浓度为200μM。为检测胭脂素对CRC细胞在体外增殖和转移的影响,Ca CO2和SW480细胞在体外分别经过不同浓度(0μM、10μM、40μM和80μM)的胭脂素刺激24小时后,通过CCK-8(Cell Counting Kit-8)和5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(5-Ethynyl-2′-deoxyuridine,Ed U)检测细胞增殖,通过成克隆试验检测细胞在体外的存活能力,通过transwell试验检测细胞在体外转移和侵袭能力。为检测胭脂素对CRC细胞凋亡的影响,Ca CO2和SW480细胞在体外分别经过不同浓度(0μM、40μM和80μM)的胭脂素或不同浓度(100 ng/ml和200 ng/ml)的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)或者二者联合刺激24小时后,通过Annexin V/propidium iodide(PI)双染法结合购买MLN4924流式细胞术检测细胞凋亡比例,并通过western blot检测剪切后Caspase 3、剪切后Caspase 9、Bcl-2(B-cell lymphoma-2)和Bax(BCL2-Associated X)蛋白的含量。为检测胭脂素对CRC细胞中AMP依赖的蛋白激酶(Adenosine 5‘-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK)通路、内质网应激和自噬的影响,Ca CO2和SW480细胞在体外分别经过不同浓度的胭脂素或TRAIL或二者联用刺激后,通过western blot检测AMPK、磷酸化AMPK(p-AMPK)、蛋白激酶RNA样内质网激酶(protein kinase RNA–like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、磷酸化PERK(p-PERK)、葡萄糖调节蛋白(glucose-regulated protein 78,GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)、真核翻译起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2,e IF-2α)、磷酸化e IF-2α和转录激活因子4(activating transcription factor 4,ATF4)的表达。为检测AMPK通路在胭脂素诱导内质网应激和拮抗CRC中的作用,Ca CO2和SW480细胞在体外经AMPK特异性抑制剂Compound C预处理后再给与胭脂素,检测细胞增殖、转移和凋亡,并检测内质网应激相关蛋白的表达。为检测胭脂素诱导细胞自噬与AMPK通路之间的关系,通过不同浓度胭脂素处理Ca CO2和SW480细胞,检测自噬蛋白、细胞增殖蛋白LC-3B、Beclin-1、p-m TOR、p-p70S6K、p-4EBP、p-ACC的表达水平,在加入AMPK抑制剂Compound C处理后,检测自噬蛋白和p-AMPK的表达水平。为检测胭脂素在体内对CRC细胞的抑制作用,建立Ca CO2的裸鼠荷瘤模型,给与100 mg/kg的胭脂素或者胭脂素联合Compound C(10 mg/kg)后,观察不同时间点肿瘤的生长,在肿瘤种植第21天处死小鼠称量肿瘤重量,通过苏木素/伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色对小鼠心、肝、肺和肾进行组织学检测。结果:低于80μM的胭脂素处理对HIEC和NCM460细胞没有表现出明显的毒性作用,而40μM和80μM的胭脂素处理显著抑制了Ca CO2和SW480细胞体外的增殖和Ed U染色阳性细胞数。此外,胭脂素处理可以剂量依赖的方式显著抑制Ca CO2和SW480细胞集落的形成。与0μM胭脂素处理的对照组细胞相比,随着胭脂素浓度的增加,Ca CO2和SW480细胞的划伤修复率越来越低,80μM胭脂素处理的细胞伤口增大明显。并且transwell检测的结果表明,胭脂素处理以剂量依赖性方式显著减少了迁移和侵袭细胞的数量,80μM胭脂Regorafenib作用素处理的细胞迁移率和侵袭率均低于50%。TRAIL和胭脂素均能以剂量依赖性方式诱导Annexin V/PI阳性的Ca CO2和SW480细胞显著增加,而与胭脂素联合处理,即使在较低剂量下,也能够增chemically programmable immunity强TRAIL对CRC细胞的促凋亡能力。此外,免疫印迹分析表明,在Ca CO2和SW480细胞系中,与TRAIL、胭脂素单独处理相比,TRAIL和胭脂素联合处理增加了caspase依赖的细胞凋亡,因为它诱导更高水平的剪切后Caspase 3、剪切后Caspase 9和Bax,与TRAIL、胭脂素单独处理相比,二者联合处理显著降低了Bcl-2表达水平。单独使用TRAIL或胭脂素处理可增加磷酸化PERK(p-PERK)和磷酸化e IF2α(p-e IF2α)的水平,以及GRP78、CHOP和ATF4的蛋白质水平。而胭脂素和TRAIL的联合处理增强了这种效果,使磷酸化PERK(p-PERK)和磷酸化e IF2α(p-e IF2α)的水平,以及GRP78、CHOP和ATF4的蛋白质水平均得到显著提升。胭脂素还能增加CRC细胞中p-AMPK水平,与TRAIL联合处理后p-AMPK表达增强。经过AMPK特异性抑制剂Compound C处理后,显著抑制了胭脂素与TRAIL单独诱导和联合诱导的p-AMPK、p-PERK、p-e IF2α、GRP78、ATF4和CHOP蛋白表达水平的上调。单独使用胭脂素处理LC3BⅡ/Ⅰ,Beclin-1水平增加,磷酸化m TOR(p-m TOR)、磷酸化p70S6K(p-p70S6K)和磷酸化4EBP(p-4EBP)水平降低,磷酸化ACC(p-ACC)水平升高,而加入AMPK特异性抑制剂Compound C后,与不加入胭脂素组相比,LC-3BⅡ/Ⅰ的比值、Beclin-1和磷酸化AMPK(p-AMPK)表达水平增加。Compound C处理可以减弱胭脂素对体外Ca CO2和SW480细胞增殖的抑制作用,以及逆转胭脂素诱导的Ed U阳性细胞数量的下调。Compound C处理可以消除胭脂素对CRC细胞迁移和侵袭的抑制作用。Compound C也能抑制胭脂素诱导的Ca CO2和SW480细胞凋亡。体内实验结果表明,胭脂素处理显著抑制了携带Ca CO2肿瘤移植小鼠的肿瘤生长,而Compound C处理降低了胭脂素的抗肿瘤能力。胭脂素和Compound C单独处理与联合处理对小鼠体重无显著影响。此外,组织学分析数据表明,用胭脂素和Compound C单独处理与联合处理对小鼠主要器官,包括心脏、肝脏和肾脏没有毒性。结论:综上所述,本研究结果表明,胭脂素在体外实验以及裸鼠荷瘤模型中表现出了抑制CRC细胞增殖、转移和侵袭的作用,并促进CRC细胞的凋亡,对正常细胞和组织器官无明显的毒性。研究结果还揭示胭脂素激活AMPK通路从而诱导CRC细胞发生内质网应激,是其抑制CRC作用的机制,为CRC等恶性肿瘤提供一种潜在的新型治疗手段。