目的:基于中医学“异病同治”理论,应用网络药理学预测芪明颗粒防治糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)的关键靶标及关键通路,并通过动物实验,观察芪明颗粒对早期糖尿病大鼠(Diabetes mellitus,DM)肾损害的保护作用,评价其调控NF-κB/NLRP3通路保护糖尿病大鼠肾损害的分子机制,为芪明颗粒防治DN提供新的科学依据。方法:1.芪明颗粒网络药理学研究:分别以芪明颗粒组成药物为关键词在中药系统药理学分析平台数据库(TCMSP)搜索各药物活性成分,Swiss Target Prediction数据库预测并筛选活性成分的潜在作用靶点。OMIM、Gene Cards、TTDSB203580 IC50、CTD、Dis Ge NET和Pharm GKB 6个数据库分别预测糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)和DN相关靶点,韦恩(Venn)映射芪明颗粒“异病同治”的交集靶点。STRING数据库和Cytoscape3.9.1软件构建靶点蛋白PPI互作网络图并筛选芪明颗粒治疗DN的核心靶点。Metascape数据库平台对核心靶点进行GO功能富集分析和KEGG信号通路分析,预测芪明颗粒治疗DN可能的作用途径。2.芪明颗粒对DN大鼠保护效应研究:SD大鼠通过高脂高糖饲料联合腹腔注射STZ(35 mg/kg)诱导DN大鼠模型,随机分为模型组、芪明颗粒低、中、高剂量组、阳性对照组,另设空白对照组,每组10只,灌胃12周,观察大鼠的一般情况(体重、血糖、摄食量、饮水量以及精神状态),采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测尿微量白蛋白、尿肌酐、血清Scr和BUN水平,HE染色和PAS染色观察肾脏组织病理变化,评估芪明颗粒对DN大鼠的保护效应。3.芪明颗粒对DN大鼠肾组织NF-κB/NLRP3通路的调控作用研selleck HPLC究:结合DN研究进展和网络药理学分析结果,本实验研究选取NF-κB/NLRP3信号通路探讨芪明颗粒对DN大鼠肾脏炎症损伤的抑制作用。采用ELISA检测DN大鼠血清炎症因子IL-1β、IL-18的表达,免疫组织化学(IHC)检测NF-κB P65在肾组织的表达,蛋白免疫印迹法(WB)检测大鼠肾组织NF-κB/NLRP3通路关键蛋白NF-κB p65、Phospho-NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1的表达。结果:1.网络药理学分析:通过搜索TCMSP数据库共筛选得芪明颗粒94个有效活性成分,358个潜在作用靶点。在6个疾病数据库共预测DN和DR各13857个、4123个疾病靶点,Venn映射得214个交集靶点,拓扑参数分析得到60个关键靶点,这些可能是芪明颗粒发挥作用的主要靶点。通过对关键靶点进行基因GO功能分析和KEGG富集分析,提示芪明颗粒治疗可能与凋亡信号传导、细胞因子介导、细胞分化的负调控及细胞-细胞粘附的调节、蛋白激酶结合、DNA转录因子结合等生物功能有关,NF-κB信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、PI3K/AKT信号通路、Fox O信号通路等可能是芪明颗粒发挥作用的关键通路。2.芪明颗粒对DN模型大鼠的保护作用:(1)与对照组相比,芪明颗粒在一定程度上可改善DN模型大鼠的一般情况,但在体重和血糖的改善方面没有统计学意义(P>0.05);(2)肾功能保护:与对照组相比,模型组大鼠尿UACR、血清Scr和BUN显著升高(P<0.01);芪明颗粒中、高剂量及二甲双胍可明显降低DN模型大鼠尿UACR、血清Scr和BUN水平(P<0.01 or P<0.05);(3)HE和PAS染色显示,模型组大鼠肾肾小球系膜增生、基底膜增厚、肾小管上皮细胞空泡变性严重,伴有大量炎症细胞浸润;各药物组肾小球系膜细胞增生和细胞外基质沉积减少,肾小管上皮细胞肿胀减轻,肾小管基底膜仅出现局部增厚,炎性细胞减少,以芪明颗粒高剂量组减轻最明显。3.芪明颗粒对DN大鼠肾组织NF-κB/NLRP3通路的调控作用:(1)ELISA检测结果显示,模型组大鼠血清IL-1β、IL-18水平显著高于对照组(P<0.01),芪明颗粒中、高剂量和二甲双胍显著下调了DN大鼠血清促炎细胞因子IL-1β、IL-18水平(P<0.01),芪明颗粒低剂量组与模型组相比没有统计学意义(P>0.05);(2)IHC染色结果显示,模型组大鼠NF-κB p65在肾脏的表达增多,着色明显,芪明颗粒各剂量不同程度减少了NF-κB p65在肾脏的表达,着色变浅;(3)WB检测结果显示,各药物组显著降低NF-κB/NLRP3通路关键蛋白Phospho-NF-κB p65、NLRP3、ASC、Caspase-1的表达(P<0.01 or P<0.05)。结论:芪明颗粒在一定程度可改善DN模型大鼠的一般情况和“三多一少”症状,对DN大鼠肾功能损伤、肾组织病理损害有显著保护作用,其分子机制可能是槲皮素、黄芪甲苷、葛根素、枸杞多糖及水蛭素等多个化学成分通过调控NFHospital infection-κB/NLRP3信号通路,影响IL-1β和IL-18炎症因子介导的肾组织炎症损伤。