乳腺癌约占女性所有类型癌症的25%,三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)约占乳腺癌的15%～20%。TNBC是一种高度异质性和侵袭性的癌症,在所有乳腺癌亚型中死亡率较高、预后较差,其分子特点是雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体2表达均为阴性。以蒽环类药物为基础的(新)辅助化疗目前仍然是TNBC的标准治疗方案之一。与多柔比星相比,吡柔比星(Pirarubicin,THP,又称吡喃阿霉素)与其疗效相当,但THP心脏毒性更低,获得广泛应用。然而,化疗尚未形成特别有效的TNBC靶向治疗策略。因此迫切需要寻找新的药物干预靶点,为TNBC的诊断、治疗和预后提供新的理论依据。环状RNA(circular RNA,circ RNA)等非编码RNA(non-coding RNA,nc RNA)参与细胞的各种生理病理过程。Circ RNA可以发挥竞争性内源RNA(Competitive endogenous RNA,ce RNA)的作用,通过海绵吸附微小RNA(micro RNA,mi RNA),进而减弱mi RNA对它所靶向的m RNA的抑制作用。虽然circ RNA具有作为TNBC诊断和预后生物标志物的潜在价值,且在TNBC的恶性进展中发挥着重要作用,但其在TNBC中发挥作用的机制,及其是否介导THP的抗肿瘤作用尚不清楚,亟需深入进行研究。本研究旨在筛选与TNBC组织和THP治疗相关的目标circ RNAs,通过体内外实验,运用多种实验方法,从circ RNA的角度为TNBC的恶性进展以及THP抗TNBC作用机制提供理论支撑。本研究共分为3部分:(1)Circ RNA基因芯片的生物信息学分析与circ EGFR/mi R-1299/EGFR通路的级联和验证本研究通过将文献报道的TNBC组织circ RNA测序结果与本课题组的THP干预MDA-MB-231细胞circ RNA测序结果取交集,筛选得到在TNBC组织中显著上调且位居首位,但在THP干预MDA-MB-231细胞中显著下调且位居首位的circ EGFR。Sanger测序、琼脂糖凝胶电泳、核糖核酸酶R实验和放线菌素D实验均证明circ EGFR具有环状结构且真实存在。核质分离实验证明circ EGFR主要分布在细胞质中,提示它主要在细胞质中发挥作用。在细胞水平,THP干预MDACSF AD biomarkers-MB-231细胞后,发现circ EGFR表达显著下调,与THP干预MDA-MB-231细胞芯片测序结果一致;circ EGFR在TNBC细胞(MDA-MB-231、HCC1806和MDA-MB-468)中特异性高表达。收集临床38对TNBC组织及其配对正常乳腺组织样本,证实circ EGFR在TNBC组织中高表达,与TNBC组织芯片测序结果一致;circ EGFR的高表达与患者较差的总生存期及无病生存期相关;受试者工作曲线分析显示,circ EGFR的表达量能够较好地区分TNBC组织和配对正常乳腺组织。表明TNBC患者组织中的circ EGFR具有作为TNBC诊断及预后生物标志物的潜在价值。提取分离49例TNBC患者及40例非TNBC患者血浆外泌体,证实circ EGFR在TNBC患者血浆外泌体中高表达。在49例TNBC患者血浆外泌体中,circ EGFR的高表达仅与患者较差的无病生存期相关;在10例经蒽环类新辅助治疗的TNBC患者血浆外泌体中,circ EGFR的表达下调。表明TNBC患者血浆外泌体中的circ EGFR具有作为TNBC预后生物标志物的潜在价值。随后使用circ Bank和Circular RNA Interactome分别预测与circ EGFR有结合位点的mi RNAs,二者取交集筛选得到3个候选mi RNAs,但仅mi R-1299与TNBC患者预后显著相关,因此确定mi R-1299作为下一步研究对象。对mi R-1299的靶基因进行京都基因与基因组百科全书信号通路富集分析,结果显示EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药信号通路p值最小。进一步将EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药信号通路中mi R-1299的靶基因与THP干预MDA-MB-231细胞m RNA测序结果取交集得到14个候选m RNAs,其中包含circ EGFR的亲本基因人表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR),且EGFR在EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药信号通路中具有重要作用,因此确定EGFR作为进一步研究对象。使用Targetscan数据库发现EGFR m RNA的3’-非翻译区处与mi R-1299存在结合位点。由此级联得到circ EGFR/mi R-1299/EGFR通路。采用双荧光素酶报告基因实验证实,circ EGFR与mi R-1299存在1个结合位点;mi R-1299与EGFR存在1个结合位点。在38例TNBC组织中,mi R-1299显著低表达,EGFR显著高表达,且circ EGFR表达量与mi R-1299表达量呈负相关,与EGFR表达量呈正相关,mi R-1299表达量与EGFR表达量呈负相关,符合ce RNA机制特征,进一步间接证明三者存在相互调控关系。(2)THP通过circ EGFR/mi R-1299/EGFR通路抑制MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化采用稳定过表达和稳定沉默circ EGFR的慢病毒转染MDA-MB-231细胞,成功构建稳定表达细胞株。过表达circ EGFR可促进MDA-MB-231细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal trselleck Tofacitinibansition,EMT),降低细胞对THP干预的敏感性;沉默circ EGFR则起相反作用。本研究证实THP可以抑制MDA-MB-231细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT,而circ EGFR的过表达可以部分阻断THP的上述作用。说明THP可以通过下调circ EGFR抑制MDA-MB-231细胞恶性表型。为证实circ EGFR、mi R-1299和EGFR之间的调控关系,通过RT-q PCR和Western blot检测circ EGFR对其下游mi R-1299及EGFR的影响,发现过表达circ EGFR可下调mi R-1299表达,上调EGFR m RNA和蛋白表达;沉默circ EGFR作用则相反;此外,mi R-1299 mimics可以部分阻断过表达circ EGFR上调EGFR的作用。证明circ EGFR与mi R-1299、mi R-1299与EGFR在MDA-MB-231细胞中存在靶向调控关系,与双荧光素酶报告基因实验结果一致。为进一步证实circ EGFR是通过mi R-1299/EGFR发挥促进MDA-MB-231细胞恶性表型的作用,本研究通过挽救实验发现,过表达circ EGFR可以促进MDAMB-231细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT;而mi R-1299 mimics不仅可以抑制MDA-MB-231细胞的恶性表型,还可以部分阻断上述过表达circ EGFR促进细胞恶性表型的作用。本研究还发现mi R-1299 inhibitor可以促进MDA-MB-231细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT;而si-EGFR不仅可以抑制MDA-MB-231细胞的恶性表型,还可以部分阻断上述mi R-1299 inhibitor促进细胞恶性表型的作用。说明circ EGFR通过mi R-1299/EGFR发挥促进MDA-MB-231细胞恶性表型的作用。(3)Circ EGFR对THP抑制TNBC异种移植瘤作用的影响选用BALB/c裸小鼠作为研究对象,采用腋窝皮下注射MDA-MB-231细胞的方式成功构建异种移植瘤模型。接种稳定过表达circ EGLapatinib浓度FR MDA-MB-231细胞的裸小鼠,肿瘤生长最快,肿瘤重量最重;Ki67免疫组织化学染色阳性率最高;肿瘤组织中circ EGFR和EGFR表达显著上调,mi R-1299表达显著下调,Ecadherin蛋白表达显著降低,Vimentin和Snail蛋白表达显著升高。而接种稳定沉默circ EGFR MDA-MB-231细胞的裸小鼠肿瘤组织结果则相反。说明过表达circ EGFR可以促进TNBC异种移植瘤的恶性进展,而沉默circ EGFR结果则相反。THP可以抑制TNBC异种移植瘤的生长,降低肿瘤体积和重量;使肿瘤组织Ki67免疫组织化学染色阳性率降低;使肿瘤中circ EGFR和EGFR表达显著下调,mi R-1299表达显著上调,E-cadherin蛋白表达显著升高,Vimentin和Snail蛋白表达显著降低。而过表达circ EGFR可以部分阻断THP的上述作用。说明circ EGFR不仅介导THP抑制TNBC异种移植瘤恶性进展的作用,还使TNBC异种移植瘤对THP的治疗敏感性降低。综上所述,本研究通过体内外实验得到以下结论:(1)通过生物信息学分析筛选得到circ EGFR(hsa＿circ＿0080220)并验证,证明其在TNBC细胞系、患者组织及血浆外泌体中高表达,且与患者较差的预后相关;患者组织中circ EGFR的表达量具有区分TNBC组织和正常乳腺组织的潜在诊断价值;(2)通过生物信息学分析和双荧光素酶报告基因实验,级联并验证得到circ EGFR/mi R-1299/EGFR通路;(3)体外研究证实,过表达circ EGFR可促进MDA-MB-231细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT,降低THP治疗敏感性,而沉默circ EGFR的结果则相反;THP可通过下调circ EGFR的表达抑制MDA-MB-231细胞的恶性表型,其机制可能是通过circ EGFR/mi R-1299/EGFR通路实现的;(4)体内研究证实,过表达circ EGFR可促进TNBC异种移植瘤生长和EMT,并且导致肿瘤对THP治疗敏感性降低;沉默circ EGFR可以抑制肿瘤恶性进展。