研究背景骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种以骨量低下、骨组织微结构损伤导致骨脆性增加、容易发生骨折为特征的一种全身性进展性骨病。该病常见于绝经后女性和50岁以上男性。骨质疏松症是一个巨大且日益严重的公共卫生问题,其发病机制十分复杂,涉及骨骼细胞功能的局部和全身调节之间的复杂相互作用。在细胞层面,成骨细胞和破骨细胞之间的交流和耦合在骨重塑的过程中发挥关键作用。这两类细胞之间分化和功能协调的不平衡是骨质疏松症发病的基础。近年来,骨骼细胞中能量生成和利用的机制也逐渐引起了重视。成骨细胞与破骨细胞在发挥各自的生物学功能时,需要消耗大量的能量。当骨骼细胞发生能量代谢障碍时,会导致骨代谢平衡紊乱,引起骨质疏松症等相关疾病的发生发展。研究表明,成骨细胞和破骨细胞的能量代谢特点有所不同,两种细胞主要的能量来源是葡萄糖。糖酵解是成骨细胞分化过程中满足三磷酸腺苷(ATP)需求的主要代谢途径。乳酸是成骨细胞中葡萄糖代谢的主要最终产物。破骨细胞融合的过程需要大量能量,其每表面积的线粒体比几乎任何其他细胞都多。破骨细胞从循环的单核细胞前体分化以及融合过程主要是由氧化磷酸化驱动的。共激活因子相关的精氨酸甲基转移酶1(Coactivator associated arginine methyltransferase 1,CARM1),是转录的共同调节因子之一。最近的研究发现CARM1在自噬、新陈代谢和早期发育中发挥重要作用。在代谢调控方面,研究表明CARM1对丙酮酸激酶异构体M2(PKM2)的甲基化使乳腺癌细胞的代谢平衡从氧化磷酸化转向有氧糖酵解。然而,CARM1能否调控成骨细胞或破骨细胞的能量代谢尚不清楚,其在骨质疏松症发病中的作用也未阐明。研究目的(1)探究CARM1在骨质疏松症中的表达变化,及其对细胞成骨、破骨分化过程的影响。(2)探讨CARM1调控成骨细胞及破骨细胞葡萄糖代谢的机制。(3)探讨干预CARM1的表达对骨质疏松症模型小鼠骨质的影响,并为临床探索有效缓解骨质疏松症的途径增加新研究基础。研究方法第一部分:CARM1对细胞成骨分化、破骨分化影响的研究,CARM1对骨质疏松症模型小鼠的作用研究1.1分析数据库资源,使用患者来源的标本进行验证(1)分析GSE156508数据(从骨质疏松性骨折或严重骨关节炎女性获得的原代成骨细胞中的表达数据),明确CARM1的表达量变化。(2)分析数据集GSE176265(RANKL介导的破骨细胞分化过程中的基因表达谱分析),明确Carm1的表达量变化。(3)RT-qPCR实验验证骨质疏松症及对照组患者来源的骨标本中的CARM1的表达量。1.2 CARM1对成骨分化的影响(1)在MC3T3-E1细胞系中过表达、敲除Carm1,并进行成骨诱导分化,通过茜素红(ARS)染色、碱性磷酸酶(ALP)染色检测细胞成骨分化水平。(2)通过RT-qPCR、Western blot、细胞免疫组化实验检测MC3T3-E1细胞成骨相关基因的表达变化。1.3 CARM1对破骨分化的影响(1)在RAW264.7细胞系中过表达、敲除Carm1,并进行破骨诱导分化,通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、细胞F-actin染色检测细胞破骨分化、成熟水平。(2)通过RT-qPCR、Western blot、细胞免疫组化实验检测RAW264.7细胞破骨相关基因的表达变化。1.4 CARM1对骨质疏松模型小鼠的作用(1)将C57BL/6野生型雌性小鼠分为假手术组、骨质疏松症组、治疗组,骨质疏松症组、治疗组小鼠行双侧卵巢切除术。(2)假手术组小鼠股骨骨髓腔内注射等体MDV3100分子量积PBS,骨质疏松症组小鼠股骨骨髓腔内注射对照组慢病毒,治疗组小鼠股骨骨髓腔内注射Carm1过表达慢病毒。4周后通过生物发光实验检测慢病毒感染情况。(3)8周后处死小鼠,股骨取材,通过RT-qPCR实验检测股骨骨组织Carm1表达量。通过micro-CT检测骨组织静态参数,通过切片免疫组化检测成骨、破骨相关基因的表达,通过马松染色检测骨胶原形成情况,通过TRAP染色检测破骨细胞分化、成熟度。第二部分:CARM1调控成骨细胞及破骨细胞葡萄糖代谢的研究2.1 CARM1对细胞葡萄糖代谢的影响(1)在MC3T3-E1和RAW264.7细胞系中过表达、敲除Carm1,进行细胞糖酵解速率(ECAR)及线粒体压力(OCR)的检测。(2)通过JC-10实验进行线粒体膜电位的检测。2.2 CARM1影响糖酵解通量的具体途径(1)利用代谢组学检测明确MC3T3-E1和RAW264.7细胞Carm1过表达后,差异代谢物的种类。(2)通过磷酸果糖激酶-1(PFK1)活性检测实验,验证代谢组学检测结果,应用糖酵解抑制剂DCA,通过ARS、ALP染色观察抑制糖酵解后,CARM1对细胞成骨分化的影响。(3)应用PFK1的抑制剂PFK15,通过ARS、ALP染色,Westernblot实验观察抑制PFK1活性后,CARM1对细胞成骨分化的影响。第三部分,CARM1调控PFK-1活性的机制研究3.1 CARM1调控PFK1活性的研究(1)通过转录组学检测和KEGG分析,明确CARM1调控的基因及信号通路,寻找影响PFK1活性的上游因子。(2)通过Western blot实验检测Carm1过表达及敲除细胞的PFK1、6-磷酸果糖激酶-2(PFKFB3)磷酸化水平变化。(3)通过Western blot实验检测Carm1过表达及敲除细胞的AKT/AMPK磷酸化水平变化。3.2 AKT/AMPK磷酸化介导CARM1调节PFK1活性的研究(1)应用AKT抑制剂MK2206,通过PFK1活性检测,观察AKT在CARM1调控PFK1活性中的作用。(2)应用AKT抑制剂MK2206,通过ARS、ALP染色检测Carm1过表达细胞的成骨分化情况。通过Western blot实验检测Carm1过表达细胞的成骨相关基因表达情况。(3)应用AKT激活剂SC-79,并在此基础上应用PFK1的抑制剂PFK15,通过ARS、ALP染色检测Carm1敲除细胞的成骨分化情况。通过Western blot实验检测Carm1敲除细胞的成骨相关基因表达情况。(4)应用AMPK抑制剂Compound C,通过TRAP染色检测Carm1过表达细胞的破骨分化情况。第四部分,CARM1调控AKT/AMPK磷酸化水平的机制研究4.1 CARM1与PPP1CA相互作用的研究(1)通过分析CARM1 GST-pulldown结果,明确AKT/AMPK磷酸化的上游调控因子。(2)通过免疫共沉淀、免疫荧光、Biacore试验明确CARM1与PPP1CA的直接相互作用。4.2 PPP1CA的甲基化位点检测及验证(1)通过体外甲基化实验及串联质谱法(MS/MS)分析,检测PPP1CA的甲基化位点。(2)通过体外甲基化实验、体外转录、翻译实验、液体闪烁计数、放射自显影实验明确PPP1CA的主要甲基化位点。4.3 PPP1CA-R23甲基化在CARM1调控葡萄代谢调节成骨、破骨分化中的作用研究(1)通过ECAR实验检测PPP1CA-R23甲基化对于CARM1调控糖酵解的作用。(2)通过Western blot实验检测PPP1CA-R23甲基化对于CARM1调控AKT/AMPK磷酸化的作用。(3)通过ARS、ALP染色检测PPP1CA-R23甲基化对于CARM1调控成骨分化的作用,通过TRAP染色检测PPP1CA-R23甲基化对于CARM1调控破骨分化的作用。通过Western blot实验检测PPP1CA-R23甲基化在Carm1过表达细胞的成骨、破骨相关基因表达情况。第五部分,CARM1调控细胞葡萄糖有氧代谢的机制研究5.1 PDK3参与CARM1调控细胞有氧代谢的研究(1)通过分析转录组学数据,寻找CARM1调控细胞有氧代谢的下游因子。ABT-199分子量(2)验证丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)家族成员在骨质疏松症患者骨质标本中的表达量变化。(3)通过Western blot实验检测PDK3在Carm1过表达/敲除细胞的表达量。5.2 CARM1调控PDK3表达量的机制研究(1)通过检索Cistrome Data Browser数据库,寻找PDK3的转录因子。(2)通过染色质免疫共沉淀实验验证PDK3的转录因子。(3)通过免疫共沉淀、免疫荧光实验验证CARM1与EP300在调节PDK3表达量的共同作用。5.3 PDK3在CARM1调控葡萄代谢、调节成骨、破骨分化中的作用研究(1)通过OCR实验、JC-10染色检测PDK3对于CARM1调控葡萄糖有氧代谢的作用。(2)通过ROS水平检测、NADP+/NADPH比例、GSH浓度检测PDK3对于Carm1过表达细胞的活性氧水平的影响。通过Western blot实验检测PDK3对于Carm1过表达细胞的PDH磷酸化水平影响。(3)通过TRAP染色检测PDK3对于Carm1过表达细胞的破骨分化的影响。(4)应用AMPK激活剂AICAR,并在此基础上转染siPdk3,通过TRAP染色检测Carm1敲除细胞的成骨分化情况。通过Western blot实验检测Carm1敲除细胞的破骨相关基因表达情况研究结果第一部分:CARM1对细胞成骨分化、破骨分化影响的研究,CARM1对骨质疏松症模型小鼠的作用研究1.1 CARM1在骨质疏松症中的表达变化(1)GSE156508数据提示CARM1在骨质疏松性骨折患者的原代成骨细胞中表达下调。(2)GSE176265数据提示Carm1在小鼠骨髓来源的巨噬细胞破骨分化过程中表达下调。(3)RT-qPCR结果提示,与对照组相比,骨质疏松症组患者的CARM1表达下调。1.2 CARM1促进MC3T3-E1细胞系的成骨分化(1)RT-qPCR结果提示,Carm1-OE组MC3TE-E1细胞的成骨诱导以时间依赖的方式上调了成骨相关基因的表达,包括骨钙素(Ocn)、骨桥蛋白(Spp1)和I型胶原蛋白α1(Col1a1)。(2)ALP染色和ARS染色结果显示,ALP活性和细胞外基质矿化在Carm1过表达的MC3TE-E1细胞中明显升高,Carm1敲除细胞的结果呈现相反趋势。(3)Western blot和细胞免疫组织化学结果显示,Carm1过表达明显增加了成骨相关基因的蛋白表达(OCN、SPP1、COL1A1、ALP)。1.3 CARM1抑制RAW264.7细胞系的破骨分化(1)RT-qPCR结果提示,随着诱导时间的增加,破骨相关基因,包括组织蛋白酶K(Ctsk)、肿瘤坏死因子家族成员11(Rankl)和活化T细胞胞质核因子1(Nfatc1),在Carm1-OE组细胞明显下调。(2)TRAP染色、F-肌动蛋白环形成实验结果提示,Carm1过表达抑制破骨细胞分化,而Carm1敲除明显增加了破骨细胞的数量和成熟度。(3)Western blot和细胞免疫组织化学结果显示,Carm1过表达下调了破骨相关基因的蛋白表达(CTSK、RANKL、NFATC1、C-FOS)。1.4 CARM1的补充改善了骨质疏松症模型小鼠的骨质(1)生物发光结果显示,骨质疏松症组小鼠和治疗组小鼠经过股骨髓腔内注射后分别感染了 Carm1-NC和Carm1-OE慢病毒,处死小鼠后取股骨进行RT-qPCR结果提示,Carm1在治疗组小鼠股骨组织中表达升高。(2)micro-CT分析结果提示,治疗组小鼠的骨密度(BMD)、松质骨体积/组织体积(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁数量(Tb.N)均高于骨质疏松症组;骨小梁分离度(Tb.Sp)和皮质孔隙度(Ct.Po)较骨质疏松症组明显下降。(3)苏木精-伊红(H&E)染色及马松(Masson)染色结果显示,骨质疏松症组小鼠的骨小梁及骨胶原明显少于治疗组及假手术组,TRAP染色结果显示,骨质疏松症组小鼠的破骨细胞形成的数量明显多于另两组。(4)免疫组化染色提示,治疗组小鼠骨切片中OCN、SPP1的表达较骨质疏松症升高。而破骨相关蛋白CTSK、RANKL和NFATC1的表达则明显下调。第二部分:CARM1调控成骨细胞及破骨细胞葡萄糖代谢的研究2.1 CARM1介导成骨细胞及破骨细胞葡萄糖代谢重编程(1)在MC3T3-E1和RAW264.7细胞中,Carm1过表达显著提高了细胞外酸化率(ECAR)。(2)在MC3T3-E1和RAW264.7细胞中,Carm1敲除明显增加了细胞耗氧率(OCR)并减少了乳酸的产生。(3)线粒体膜电位(ΔΨm)的测量也表明,Carm1敲除组的ΔΨm较对照组升高。2.2 CARM1通过上调磷酸果糖激酶1的活性调节糖酵解通量(1)代谢组学分析提示,在MC3T3-E1和RAW264.7细胞Carm1过表达组中,1,6-二磷酸果糖是明显上调的代谢物。(2)PFK1活性检测结果表明,Carm1过表达组细胞的PFK1活性明显高于对照组。(3)使用DCA抑制糖酵解后,MC3T3-E1 Carm1过表达组细胞的成骨分化减弱。同时,应用PFK1抑制剂PFK15后,ALP和ARS结果提示,CARM1促进成骨分化的作用能够被PFK15逆转。第三部分,CARM1调控PFK-1活性的机制研究3.1 CARM1的过表达上调AKT/AMPK的磷酸化水平(1)转录组学检测及京都基因和基因组百科全书(KECAU chronic autoimmune urticariaGG)分析显示,PI3K-AKT信号通路是有差异表达基因(DEGs)的主要富集通路之一。(2)Western blot结果表明,在MC3T3-E1细胞中Carm1的过表达上调了 AKT的磷酸化水平,包括Thr450、Thr308和Ser473。(3)Western blot结果表明,在RAW264.7细胞中,Carm1的过表达没有引起AKT磷酸化水平的改变,但AMPK-Thr172磷酸化水平升高。3.2磷酸化AKT/AMPK介导Carm1过表达组细胞的PFK-1、PFKFB3活性升高(1)PFK活性测试显示,在MC3T3-E1和RAW264.7细胞中,CARM1对PFK活性的调节可以分别被MK2206(AKT抑制剂)和CompoundC(AMPK抑制剂)所逆转。(2)ALP染色和ARS染色结果显示,MK2206阻止了 CARM1促进成骨细胞的分化。SC79(AKT激活剂)挽救了 Carm1敲除引起的成骨分化抑制,PFK15再次逆转了这种调节。Western blot结果表明,受CARM1调控的成骨细胞相关基因(Ocn、Spp1、Col1a1)的表达也受到AKT抑制剂和激活剂的影响。(3)在RAW264.7细胞诱导破骨分化过程中,Carm1过表达对破骨细胞分化的抑制被Compound C所挽救。第四部分,CARM1调控AKT/AMPK磷酸化水平的机制研究4.1 CARM1与PPP1CA相互作用(1)免疫共沉淀结果表明,CARM1与PPP1CA存在相互作用。(2)Biacore实验结果显示,CARM1与PPP1CA结合强度随着蛋白浓度的增加而增加。(3)共聚焦显微镜图像显示CARM1和PPP1CA在细胞质和细胞核中的分布。4.2 CARM1 在 R23、R142 和 R317 处甲基化 PPP1CA(1)PPP1CA在进化过程中高度保守,小鼠、大鼠、人的PPP1CA氨基酸序列一致。(2)采用体外甲基化试验及液相色谱与串联质谱法(LC-MS/MS)鉴定出三个PPP1CA的精氨酸甲基化位点,分别是R23、R142和R317。4.3 R23是PPP1CA主要的甲基化修饰位点(1)放射自显影结果提示PPP1CA-R23位点的突变,导致3H-SAM作为甲基供体的甲基化在PPP1CA明显降低。(2)液体闪烁计数结果显示,突变所有三个位点(R23、R142和R317)或突变R23位点导致PPP1CA 3H计数率显著下降。R23突变阻止了 CARM1介导的PPP1CA甲基化。4.4 PPP1CA-R23甲基化在CARM1调控葡萄代谢、调节成骨、破骨分化中发挥重要作用(1)PFK活性检测结果表明,突变所有三个位点(R23、R142和R317)或突变R23位点会显著降低Carm1的过表达细胞的PFK1活性。并降低MC3T3-E1和RAW264.7细胞的糖酵解速率。(2)Western blot结果表明,Carm1的过表达细胞中,PPP1CA三个位点全突变(R23、R142和R317)或R23突变,下调了 AKT和AMPK的磷酸化水平,并引起MC3T3-E1细胞中成骨相关基因(Ocn、Spp1、Col1a1)表达的下调和RAW264.7细胞中破骨相关基因(Ctsk、Nfatc1、C-fos)的表达上调。(3)ARS和ALP结果表明,Carm1的过表达细胞中,PPP1CA三个位点全突变(R23、R142和R317)或R23突变,抑制了 MC3T3-E1细胞的成骨分化,提升了 RAW264.7细胞的破骨分化程度。第五部分,CARM1调控细胞葡萄糖有氧代谢的机制研究5.1 PDK3参与了 CARM1介导的葡萄糖代谢重编程(1)通过分析MC3T3-E1细胞的转录组数据,发现PDK家族成员的表达水平受到CARM1的调节,其中Pdk3和Pdk4的表达上调。(2)RT-qPCR检测骨质疏松症患者和对照组患者中PDK3和PDK4的表达,结果发现,PDK3的表达在骨质疏松症患者中下调,而PDK4的表达上调。在骨质疏松症的发病过程中,PDK3与CARM1的表达量保持了一致的趋势。(3)Western blot检测PDK3在MC3T3-E1和RAW264.7细胞中的表达,结果显示PDK3在Carm1-OE组的表达增加。5.2 CARM1作为EP300的转录共激活因子调控PDK3的表达量(1)色质免疫共沉淀(CHIP)实验的结果表明CARM1不是PDK3的转录因子。(2)Cistrome Data Browser检索结果与CARM1质谱结果取交集,发现EP300是PDK3的转录因子,同时能够与CARM1结合。(3)免疫共沉淀实验与细胞免疫荧光染色结果表明EP300与CARM1存在相互作用。5.2 CARM1通过上调PDK3的表达量调控细胞氧化磷酸化通量(1)OCR实验表明,Pdk3在细胞中的敲低引起细胞OCR的增加。通过敲低Pdk3,细胞ROS水平升高,ROS、NADP+/NADPH比例的增加伴随着GSH浓度的下降。(2)敲低Pdk3导致PDH磷酸化减少,PDH活性增加,并部分逆转了 CARM1诱导的代谢变化,氧化磷酸化通量增加,细胞ΔΨm升高(3)敲低Pdk3使RAW264.7 Carm1-OE组细胞的破骨分化程度升高。敲低Pdk3能够逆转AMPK激动剂AICAR诱导的破骨细胞分化抑制,并上调破骨细胞相关基因(Ctsk、Nfatc1、C-fos)的表达。结论(1)CARM1将成骨细胞和破骨细胞的葡萄糖代谢从氧化磷酸化重新编程为有氧糖酵解,从而促进成骨分化,抑制破骨分化。CARM1的补充缓解了骨质疏松症模型小鼠因卵巢切除导致的骨质流失。(2)CARM1 甲基化 PPP1CA-R23,影响 AKT-T450 和 AMPK-T172 的去磷酸化,并增加磷酸果糖激酶-1(PFK1)和果糖-2,6-二磷酸酶3(PFKFB3)的活性,引起糖酵解通量的上调。(3)作为转录辅助因子,CARM1上调丙酮酸脱氢酶激酶3(PDK3)的表达量,从而抑制丙酮酸脱氢酶(PDH)的活性,导致氧化磷酸化的通量的下调。