微滴数字 PCR 技术(Droplet Digital Polymerase Chain Reaction,微滴数字聚合酶链式反应)是三大数字PCR技术之一,可以实现对低浓度核酸样品的精准检测。近年来,微滴数字PCR技术在生物医学临床检验、基础科学研究等领域取得了广泛的应用。相对于微腔体式数字PCR技术和微孔式数字PCR技术,微滴数字PCR技术具有结构简单、成本低、拓展性强等优势,在商业化产品的竞争中脱颖而出,成为最主流的数字PCR技术。随着微滴数字PCR技术的广泛应用,临床检验和生物医学基础研究等领域向微滴数字PCR仪器提出了高灵敏度和一体化两个迫切需求。本文针对高灵敏度和一体化这两个迫切需求,提出高灵敏一体化微滴数字PCR关键技术研究,包括基于离心阶梯乳化结构的高通量微滴制备技术、集成“微滴制备-单层平铺-PCR扩增-荧光检测”的一体化微滴数字PCR技术,和基于编码照明的高通量微滴荧光检测技术,设计并搭建了相应的高灵敏一体化微滴数字PCRINCB28060配制微流控芯片、微滴生成装置、平面PCR扩增装置和高通量微滴荧光检测装置。通过对表皮生长因子受体(EGFR)T790M突变的数字PCR检测,系统性检测了本论文所搭建装置及芯片的检测灵敏度、动态范围和检测精度。本文的主要研究成果有:(1)建立了高通量离心式阶梯乳化技术制备微滴的体积模型。该模型对微滴形成过程进行动力学分析,将离心加速度引入至微滴形成过程的轮廓建模中,提出临界时间和临界球泡长度的概念,建立了一CL13900生产商种包含离心力、界面张力、接触角、阶梯乳化结构尺寸等参数在内的微滴体积模型。借助微滴制备过程的高速摄像和有限元数值模拟方法,证明了临界时间和临界球泡长度的存在,且与本模型吻合。不同离心加速度、台阶高度和台阶长度等参数下的微滴制备实验结果表明,理论微滴直径与实验结果相对误差小于4%,表明本模型可以很好的描述离心阶梯乳化过程和预测微滴体积。(2)提出了一种包含排油排气结构的离心式高灵敏一体化微滴数字PCR芯片技术,实现对高达95 000微滴的高通量制备、单层平铺、PCR扩增、荧光检测等过程在单个芯片上的集成。提出利用空气、样品和油液之间的密度差异,并利用离心微流控芯片的优势,结合排油排气结构,解决了微滴检测腔体内空气和冗余油液难以排出的难题。实验结果表明,本芯片可以在60秒内完成约95 000微滴的制备和平铺,且微滴检测腔体内无气泡和冗余油液,微滴排列紧密且无重叠。微滴破碎与融合情况基本不存在,这为高灵敏一体化数字PCR检测提供了很好的基础。(3)提出一种基于编码照明的微滴样本运动成像的高通量微滴荧光检测技术,包括理论、方法和装置。该技术有效降低了现有的大面积荧光成像装置在扫描过程中因样品“走-停-走-停”式移动而产生的机械运动时间的消耗,实现高通量微滴荧光检测。建立了一种基于编码照明的图像运动模糊模型,包括模糊矩阵和去模糊矩阵,并以模糊矩阵的条件数、点扩散函数(PSF)在频域的幅值最小值和幅值标准差作为优化参数,获得了最优化的编码照明序列。图像结构相似性(SIMM)和信噪比(SNR)指标计算结果表明,本编码照明运动模糊技术的复原效果优于传统的曝光去模糊效果。搭建了基于编码照明运动模糊成像的两荧光通道(HEX和FAM)微滴检测装置。通过对大功率发光二极管(LED)进行编码照明,并配合相机的曝光实现对微滴样品的运动模糊成像。建立了编码照明运动模糊成像的复原方法,并基于基础图像的灰度方差函数(SMD)得到最优化去模糊长度。实验结果表明,在9.7mm/s的运动速度下,复原后荧光图像中的微滴可以被精准的识别。在198.7 s内完成约95 000微滴的检测,在不增加任何硬件装置的条件下,检测时间下降48.9%,检测通量提升204.5%,显示出本编码照明技术的巨大潜力。建立了微滴图像拼接、基于去除背景的分水岭微滴识别方法和基于“definetherain”聚类算法的阴、阳性微滴统计方法。计算结果表明,本方法可以很好的识别阴、阳性微滴,和对微滴进行精准的分类统计。(4)构建了用于EGFR野生型和T790M突变检测的微滴数字PCR反应体系,基于本文搭建的高灵敏一体化微滴数字PCR芯片、微滴生成仪、PCR扩增仪和编码照明微滴荧光读数仪,完成了对EGFR T790M突变基因的动态范围、灵敏度和重复性等测试。测试结果表明,本文搭建的高灵敏微滴数字PCR在动态范围高达4.3 logs下,线性相关系数R2>0.99。在低至0.19 copy/μL的检测限下,检测结果变异系数(CV)为23.4%。在浓度5.00 copies/μL、50.00 copiLab Automationes/μL 和 300.00 copies/μL 时,检测结果分别为 4.61 copies/μL、53.14 copies/μL 和 299.97 copies/μL,重复性 CV 分别为 7.69%、4.49%和 8.59%,表明本微滴数字PCR仪器、芯片和方法很好的实现了高灵敏一体化的微滴数字PCR检测,有望满足临床应用提出的高灵敏度和一体化的迫切需求,和进一步推动微滴数字PCR技术的进步和应用的拓展。