【目的】4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)参与苯丙烷代谢途径,为植物中许多次生代谢物提供前体物质,调控植物RepSox配制产生木质素和类黄酮等代谢产物。4CL基因在响应生物和非生物胁迫、影响植物育性和调节环境适应性等方面都有重要作用。迄今为止,4CL基因在多个物种中被广泛研究,但棉花中此类研究的相关报道还比较少。本研究对陆地棉4CL基因家族进行鉴定,获得了陆地棉Gh4CL20/20A和Gh4CL7/25基因编辑敲除植株,研究发现Gh4CL20/20A基因编辑突变体植株雄性不育,Gh4CL7/25基因编辑突变体植株高温胁迫后花粉败育。在此基础上,初步解析了Gh4CL20/20A和Gh4CL7/25基因的功能,为进一步揭示棉花4CL基因家族功能和抗高温育种奠定基础。【方法】利用生物信息学技术对陆地棉4CL基因家族成员进行鉴定,并进行基因表达特征分析。构建Gh4CL20/20A和Gh4CL7/25基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体,遗传转化陆地棉,获得基因敲除突变体植株,鉴定并分析其表型性状;采用花粉染色,石蜡组织切片等方法,分析野生型植株和突变体植株花药和花粉形态差异;测定野生型植株和突变体植株花药中代谢产物含量,分析花药发育过程中代谢产物含量变化;采用转录组测序(RNA-seq)分析花药发育过程中基因转录水平上的差异,对差异基因进行GO和KEGG分析,初步研究Gh4CL20/20A和Gh4CL7/25基因调控花粉发育的分子机制。【结果】(1)在陆地棉基因组数据库(ZJU,version 2.1)中鉴定出35个4CL基因,其中包括8个4CL和27个4CL-like。基因表达模式发现,Gh4CL20/20A基因在花瓣和genetic adaptation花药中优势表达,Gh4CL7AM-2282/25基因主要在茎杆、根部和雌蕊中优势表达。利用农杆菌介导的棉花遗传转化方法分别获得Gh4CL20/20A和Gh4CL7/25基因编辑突变体植株。(2)与WT相比,Gh4CL20/20A基因编辑突变体植株花瓣颜色变为白色,花药发育异常,花粉粒数量明显减少,花粉形态异常且失去活性。花药组织石蜡切片发现,WT植株花粉粒形成相对完整饱满的圆型,花粉壁表面有均匀的刺突。Gh4CL20/20A基因编辑突变体植株的花粉粒形状呈现月牙状坍塌结构,花粉壁结构存在严重缺陷,尽管形成部分刺突,但其分布不均匀,花粉败育。RNA-seq分析表明,在四分体时期和成熟时期的花药中分别获得8628个和2175个差异表达基因,GO富集和KEGG分析结果表明,差异基因主要涉及花粉-雌蕊互作、花粉识别和类黄酮生物合成等;类黄酮生物合成过程中的Gh CHS、Gh CHI、Gh F3H和Gh FLS等基因在Gh4CL20/20A基因编辑突变体植株中的表达降低,花药类黄酮含量显著降低。推测Gh4CL20/20A参与调控类黄酮的生物合成过程,影响花粉活性。(3)Gh4CL7/25基因编辑突变体植株在人工气候室28℃环境下生长,表现正常可育,在38℃高温环境下花粉败育。将减数分裂时期、四分体时期、单双核时期以及成熟期各发育阶段的花蕾分别置于38℃高温环境胁迫后发现,与其他发育时期相比,四分体时期花粉生长发育更易受高温影响。花粉体外萌发实验表明,38℃高温胁迫后,Gh4CL7/25基因编辑突变体和WT花粉的萌发率均下降,但Gh4CL7/25基因编辑突变体的花粉萌发率下降更显著。与WT相比,高温胁迫下Gh4CL7/25基因编辑突变体植株花粉粒过早发育,花粉壁呈现塌陷结构,木质素含量显著降低,木质素合成相关基因表达下调。综上所述,Gh4CL7/25基因可能通过参与调控植物木质素生物合成,提高花粉粒对高温胁迫的敏感。【结论】(1)Gh4CL20/20A和Gh4CL7/25与棉花的花粉发育密切相关;(2)Gh4CL20/20A基因调控植株类黄酮生物合成,该基因编辑突变体植株雄性不育;(3)Gh4CL7/25基因参与调控木质素生物合成,该基因编辑突变体植株在高温胁迫下花粉败育。