三萜是数量最多的一类植物天然产物,在植物中确认细节,它们有着重要的生理功能。拟南芥(Arabidopsis thaliana)根中的三萜代谢网络能够调控根际菌群;葫芦素类三萜葫芦素B(Cu B)能够调控甜瓜(Cucumis melo)根际菌群,减轻甜瓜枯萎病,提升生长适应性;燕麦(Avena strigosa)根中的三萜燕麦皂苷(Avenacins)能够帮助燕麦抵御多种病原真菌;β-香树素的过量积累会引起燕麦的多根毛表型。木栓酮是一种独特的五环三萜,经历了环化过程中最高程度的重排,具有抗虫、抗菌、抗真菌和化感作用等生物活性。2,3-氧化鲨烯环化酶(OSC)是三萜合成中的关键酶,OSC催化2,3-氧化鲨烯环化形成不同的Biopurification system三萜骨架,作为进一步被修饰的结构基础,木栓酮为三萜骨架之一。木本植物在造林、造纸及工业生产等方面有重要应用,毛果杨(Populus trichocarpa)易于繁殖、生长速度快且适应性强,具有完整清晰的基因组信息,遗传转化体系成熟,是理想的木本模式植物。本研究以毛果杨为研究材料,综合利用数据库中的基因组和转录组信息,对毛果杨的OSC进行基因挖掘,结合系统发育分析,确定木栓酮合酶的候选基因,并在烟草底盘中进行瞬时表达验证其功能,利用CRISPR/Cas9技术敲除该基因获得毛果杨突变体植株,观察突变体表型,探究其作用机制,为培育新抗病树种的研究提供依据,主要研究结果如下:(1)从毛果杨基因组(Phytozome数据库)挖掘到17条OSC的基因序列,分别命名为PtOSC1～PtOSC17,其中13条序列长度超过650 aa;系统发育分析表明PtOSC6、PtOSC10和PtOSC12与已报道的木栓酮合酶基因聚在一支,可作为毛果杨木栓酮合酶的候选基因;结合转录组数据发现PtOSC6表达量明显高于其他两个基因且在根中特异表达,半定量和荧光定量PCR再次证实这一点。(2)PtOSC6在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中进行异源表达,通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析,确定了产物中存在化合物木栓酮,PtOSC6为木栓酮合酶。(3)针对PtOSC6第一和第二外显子设计了基因编辑靶点,构建了基于CRISPR/Cas9的双靶点载体,使用农杆菌介导法进行毛果杨遗传转化,利用PCR技术验证得到的转基因株系,成功获得ptosc6突变体,命名为d5,经鉴定该转化株被成功编辑,造成移码突变,翻译提前终止。(4)对突变体d5进行代谢物分析,分别提取根、茎和叶的三萜类化合物进行GCMS检测,与野生型的根相比,d5的根存在明显的代谢物差异,d5根缺少的化合物很有可能是木栓酮的下游代谢产物。在土壤培养条件下,确认细节突变体d5叶片更易出现黑斑,突变体含黑斑叶片比例和叶片黑斑数都显著高于野生型,说明该基因可能与抗病相关。本研究首次获得了木本植物OSC突变体,并对其生物学功能进行了探究,为木本植物三萜代谢物功能研究提供参考。