溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是一种以持续、反复发作为特征的慢性非特异性肠道炎症,其高发于年轻人、可致残。近年来我国UC发病率持续上升,且趋于年轻化。慢性炎症及其诱发的肠上皮屏障损伤是UC发生发展的关键一环,故抑制肠上皮炎症是UC防治的关键。牡荆素(芹菜素-8-C-葡萄糖苷)是一种C-糖苷类黄酮,具有强效抗炎的作用,在许多药用植物及食物中含量丰富,比如三叶青、山楂、荞麦、甜菜等。此外,与O-糖苷不同,C-糖苷具有相对较高的代谢稳定性,以牡荆素为代表的C-糖苷黄酮可潜在用于防治UC。然而,牡荆素对结肠炎的有益作用及其作用分子靶点尚未报道。组织热蛋白质组分析(Tissue thermal proteome profiling,Tissue-TPP)是动物活体上有效挖掘药物靶点蛋白的新技术,其基于配体诱导靶蛋白热稳定的生物物理原理来检测组织内药物和靶蛋白的结合,在研究活性小分子与蛋白质之间的相互作用上具有明显的优势。本研究首先探讨了牡荆素的体外胃肠道消化稳定性及其在小鼠体内的代谢分布;其次采用DSS诱导小鼠结肠炎症,通过检测medicinal insect体重变化、DAI评分、结肠长度、H&E染色、结肠中炎症因子及屏障蛋白表达,研究牡荆素抗结肠炎症并缓解屏障损伤的作用;最后通过Tissue-TPP结合分子对接技术鉴定牡荆素的潜在蛋白靶点,并基于TNFα诱导的Caco-2细胞炎症模型,采用si RNA基因沉默技术进一步明确该蛋白靶点是否介导了牡荆素抗炎及其作用机制。旨在为活性小分子新靶点的挖掘提供新思路,并为以牡荆素为起点开发膳食补充剂或药物高效防治炎症性疾病提供科学依据。主要研究结果如下:1.在体外模拟胃肠道消化时,牡荆素的含量未见显著改变;同时在37℃条件下,牡荆素以10μmol/L的初始浓度与大鼠血浆共孵育8 h后,仍未被降解,表明其经胃肠道消化及在血浆中具有很好的稳定性。此外,在小鼠灌胃牡荆素0.5h后,牡荆素就以原型的形式被吸收并进入到血液中,随后分布到心脏、肝脏和肾脏中,在4 h时牡荆素在结肠组织中的含量达到峰值,8 h后,其浓度虽然很低,但仍能被检出。然而,除了牡荆素外,其糖苷配基(芹菜素)及已报道的小分子酚酸代谢物(比如:3-(4-羟基苯基)丙酸、苯乙酸和3-苯基丙酸)均未被检测到,推测牡荆素的代谢很可能由特定菌群完成,而在小鼠肠道中并没有定植该类菌群。2.与DSS模型组相比,牡荆素处理显著阻止了小鼠体重的减轻、结肠长度的缩短、血便及粪便中含水量的增加,并使小鼠的疾病指数评分明显下降。H&E染色结果显示,与DSS组相比,牡荆素处理组的结肠隐窝较完整,炎性浸润范围较小。结肠中炎症因子(IL-1β、IL-6、ICAM和VCAM)的表达在经DSS诱导后显著增加,而经牡荆素处理后,上述炎症因子在蛋白和基因水平均明显降低。此外,与DSS组相比,牡荆素处理组血清TNFα和IL-1β的水平显著降低。免疫荧光及免疫印迹的结果显示,牡荆素可显著上调结肠屏障相关蛋白(Occludin、ZO-1和E-cadherin)的表达。上述结果表明,牡荆素可缓解小鼠结肠炎症及改善肠道屏障功能。3.为进一步鉴定牡荆素的抗炎作用靶点,通过Tissue-TPP技术筛选出5个与DSS组相比SDS-PAGE灰度值显著增强的蛋白条带,并利用质谱技术共鉴定到2785个蛋白,其中14个蛋白的Score>50、Unique peptides>10、Abundances>10~8。分子对接的结果表明,牡荆素与这1Liraglutide作用4个蛋白的结合能较低(<-5 kcal/mol),表明牡荆素对这14个蛋白有很强的亲和力,其中有8个蛋白(OLA1、Fahd1、Sdha、Rpn1、Acad9、Ass1、Txndc5、Wdr1)与牡荆素的结合能低于-7 kcal/mol,为牡荆素的候选靶点蛋白。值得注意的是,转录因子Nrf2是活性小分子发挥抗炎作用的关键蛋白,免疫荧光及Western blotting的结果显示牡荆素可显著提高结肠组织中Nrf2蛋白的表达。鉴于Keap1是Nrf2活化的关键,进一步利用HDOCK在线蛋白-蛋白互作软件探究上述8个候选蛋白-牡荆素复合物与Keap1蛋白的相互作用,发现OLA1和Fahd1能通过疏水作用、氢键等非共价键结合到Keap1的活性空腔上,且牡荆素位于该活性空腔中,提示OLA1-牡荆素复PD-0332991小鼠合物和Fahd1-牡荆素复合物很可能通过与Keap1结合,阻断Keap1-Nrf2复合物的形成,进而使Nrf2解离活化并抗炎。综合HDOCK对接评分及RMSD值,最终选择OLA1作为牡荆素的候选靶点蛋白,进一步的组织热位移证明了牡荆素与OLA1的结合,同时免疫荧光共定位结果证明了OLA1与Nrf2的相互作用。采用si RNA技术沉默OLA1基因的表达,发现牡荆素失去了上调Nrf2蛋白表达及抑制IL-1β和ICAM等炎症因子表达的能力。热邻近共聚结果表明,牡荆素处理后,除OLA1蛋白热稳定性增强外,OLA1和Keap1蛋白还表现出相似的熔解曲线。这些结果提示,OLA1是牡荆素的直接作用靶点,其很可能通过与Keap1互作并激活Nrf2进而抑制肠道炎症。综上所述,牡荆素在体外模拟胃肠消化和血浆共孵育过程中均表现出极强的稳定性,并可在结肠组织中大量富集;牡荆素缓解了DSS诱导的结肠炎小鼠的临床症状和结肠损伤,同时抑制结肠中炎症细胞因子的表达,促进肠道屏障蛋白的修复;OLA1作为牡荆素的直接作用靶点,与牡荆素结合后与Keap1发生相互作用,阻断Keap1与Nrf2的结合,从而使Nrf2入核,抑制炎症细胞因子的表达。