酿酒酵母生长过程中芳香醇(如:2-苯乙醇、色醇等)的产生途径主要是从头合成途径和艾氏途径。芳香醇作为一类在医药、化妆品、食品添加剂等领域应用较广泛的一类高级醇,具有极高的研究价值。目前主要通过化学合成和植物萃取方法获得,化学合成的芳香醇有害物质较多,环境污染大,纯度低;植物中提取产量低,价格昂贵,都不适用于大规模的芳香醇生产。但很多微生物都具有合成芳香醇的能力,所以通过细菌或真菌合成芳香醇成为研究的热点。本课题以从馒头发酵起子中分离得到的酿酒酵母KMLY1-2(双倍体型)为研究对象,基于先前转录组分析结果,首先选取了8个关键基因,通过同源重组敲除技术验证其在生物合成芳香醇中的作用。然后以编码未折叠蛋白反应诱导蛋白基因uli1为目标,构建了酿酒酵母CRISPR/Cas9基因编辑系统的实验平台。之后结合相关文献和进一步转录组数据挖掘,从基因组中选取了6个基因,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统研究了其对2-苯乙醇和色醇产量的影响。由于敲除uli1基因能够显著降低目标醇的Smoothened Agonist molecular weight产量,为揭示ULI1蛋白在调控2-苯乙醇合成的分子机制,将uli1基因突变菌株进行了转录组测序分析。本研究主要结果如下:(1)分析KMLY1-2菌株产不同水平芳香醇的转录组数据中得到8个疑似与2-苯乙醇和色醇合成相关的基因(thi4、syml、ctt1、pdc1、ald4、hsp104、pal和pck1)。通过同源重组敲除技术成功地在酿酒酵母KMLY1-2单倍体a型菌株中分别敲除这8个基因,结果发现:Δhsp104菌株2-苯乙醇产量上升5.05%;Δpal菌株2-苯乙醇产量下降36.61%,色醇产量上升10.14%;Δthi4菌株色醇产量下降5.34%;Δpck1菌株色醇产量上升10.99%。这为后续利用CRISPR/Cas9敲除技术进一步的改造KMLY1-2芳香醇代谢通路奠定理论基础。(2)以uli1为目标基因,在KMLY1-2-a(单倍体型)菌株中建立了CRISPR/Cas9基因编辑系统,完善了PEG-醋酸锂化学转化、重组p Cf B3052和donor DNA构建、突变菌株分子鉴Decitabine核磁定等方法,成功的获得了三株uli1基因突变型菌株(移码突变、碱基突变和基因完全丢失型)。通过HPLC对三株uli1基因突变型菌株芳香醇产量分析,发现uli1基因的突变会导致2-苯乙醇和色醇产量的显著下降,不同的突变类型对产量的影响大小也不一样,其中产量下降比最大的为移码突变型菌株Δuli1-(2),其2-苯乙醇产量从野生型的1294.52 mg/L降低至822.61 mg/L,下降率为36.43%;色醇产量从野生型的252.35 mg/L降低至187.35mg/L,下降率为25.75%。(3)结合文献和转录组分析,从目标芳香醇代谢通路或其他路径中选择了7个基因(ald3、pal、idh2、pha2、thi4、uli1和adh5)和2个位点(Ⅹ-3和Ⅻgenetic monitoring-3)。利用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行功能研究。利用供体donor DNA的同源重组修复方式,将待敲除基因序列完全删除或者用其他基因进行替换或者在敲除菌株中进行质粒过表达,最终构建得到了11株不同类型的重组菌株和3株基因过表达菌株:a-Δald3,a-Δald3::uli1;a-Δpal,a-Δpal::uli1;a-Δidh2,a-Δidh2::uli1;a-Δpha2,a-Δpha2::uli1;a-ΔⅩ-3::uli1,a-ΔⅫ-3::uli1,a-ΔⅫ-3::thi4;a-Δald3-p Y26-thi4,a-Δald3-p Y26-uli1和a-Δald3-p Y26-adh5。在HPLC分析中,发现pal基因的突变能够显著提升色醇,但却会降低2-苯乙醇产量。idh2基因的突变可以提升2-苯乙醇和色醇产量,提升率分别为8.65%和12.75%。通过以donor DNA的形式将uli1表达框整合到基因组中可以小幅度的提高产量,但没有过表达质粒对产量的提升明显。(4)为了进一步研究uli1基因影响2-苯乙醇和色醇产量的分子机制,将KMLY1-2-a和基因完全丢失型菌株a-Δuli1在转化培养基TM-7P中培养后,进行转录组测序分析。GO富集分析发现,ald3的表达上调,ALD3主要负责催化2-苯乙醛氧化形成2-苯乙酸,能够直接降低2-苯乙醇产量,这就和Δuli1菌株2-苯乙醇产量下降的结果是吻合的。thi4基因的表达在Δuli1菌株产2-苯乙醇过程中是下调的,这也就解释了为什么利用p Y26过表达质粒在KMLY1-2-a-Δald3菌株中过表达thi4基因会提高2-苯乙醇产量。KEGG富集分析表明,在苯丙氨酸代谢过程中共同调节预苯酸和苯丙酮酸的基因出现下调现象,这导致了合成2-苯乙醇上游产物的不足,或者促进了2-苯乙醇朝其他路径的代谢,最终导致了a-Δuli1菌株2-苯乙醇产量下降。