近些年来,恶性肿瘤的发病概率和致死概率一直居高不下,并逐年上升,这给社会造成了非常大的经济负担,也给患者和家庭造成了沉重的影响,因此恶性肿瘤也成了目前当之无愧的“杀手”。其中前列腺癌的发病率愈加显著,占据男性癌症死亡第二位,并且是男性生殖系统最为常见的恶性肿瘤,据统计其发病率占全球男性新诊断癌症的7%(发达地区为15%)。我国针对前列腺癌尚未有大规模的筛查工作,这也导致了新发病率中70%的患者发现时,已经是中晚期并呈现出远处转移或淋巴结转移。整体来说目前针对早期未转移的前列腺癌的治疗手段大都采取手术切除、放射治疗、免疫治疗以及内分泌治疗等单一或者多重治疗方式,但这些治疗方式也仅仅对未发生转移性去势抵抗性前列腺癌(metastatic castration-resistant prostate cancer,m CRPC)有一定的疗效,而针对m CRPC目前尚无统一有效的治疗方式,因此亟需寻找更为有效medieval European stained glasses的治疗手段以期达到治疗m CRPC,延长患者的生存率。最近的研究显示光热治疗法(photothermal therapy PTT)是治疗前列腺癌的一种较好的手段,简单来说PTT是利用具有较高光热转换效率的材料,将其注射入人体内部,利用靶向性识别技术聚集在肿瘤组织附近,并在外部光源(一般是近红外光)的照射下将光能转化为热能来杀死癌细胞的一种治疗方法。这就需要具有较好光热转换效率的材料联合激光将光能转化为热能从而杀死肿瘤细胞。同时肿瘤免疫治疗可有效激活和保护免疫系统,以抵御肿瘤细胞的侵袭,并有效地阻止其发展。这种治疗方法可以采用多种手段,如单克隆抗体、治疗性抗体、肿瘤疫苗、生物大分子药物和小Canagliflozin核磁分子抑制剂等,通过使用一系列免疫检查点抑制剂,可以有效将前列腺癌“冷肿瘤”转变为“热肿瘤”。因此本文选择具有较高光热转化效率的二维黑磷纳米片,通过一系列的合成方式并采用液相剥离手段构建成为Se@BPNSs材料,并结合前列腺癌细胞膜,其在细胞和动物层面联合Anti-PD1以期实现光热联合免疫治疗激活免疫细胞的效果,为治疗前列腺癌带来一定的临床理论意义。实验目的:为了达到光热联合免疫检查点抑制剂治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的目的,实现“冷肿瘤”转换为“热肿瘤”过程,本研究从光热材料出发,设计并合成二维材料硒掺杂的黑磷,并通过液相剥离的手段形成光热转换效率更高的Se@BPNSs。此外为了解决并实现较好的实体瘤的高通透性和滞留效应(Enhanced permeability andretention effect,EPR),我们在Se@BPNSs外层包裹了鼠源动物前列腺癌细胞膜RM-1,可以有效实现同源靶向作用。通过在瘤体注射一定剂量的Se@BPNSs@RM-1通过808nm激光的照射下,Se@BPNSs将光能转换为热能达到较高温度杀伤肿瘤细胞,同时释放的抗原可以被DC细胞所捕获。同时在此期间,我们联合免疫检查点抑制剂Anti-PD1以期放大免疫治疗,从而促进免疫细胞浸润。本研究通过在材料合成及其表征证实Se@BPNSs的成功制备,细胞层面和动物层面双向进行验证,以达到光热协同免疫治疗的目的,为治疗m CRPC带来一定的临床指导意义。实验方法:第一部分:采用液相剥离的方法制备硒掺杂的黑磷纳米片Se@BPNSs,通过一系列的表征手段,包括:透射电镜(TEM)、粉末X射线衍射(PXRD)、X射线光电子能谱仪(XPS)以及原子力显微镜(AFM)等手段证实材料的成功制备。硒的加入提高BPNSs的空气稳定性、延缓其降解,同时利用细胞膜表面特异性识别能力,用前列腺癌细胞膜包裹制备出的Se@BPNSs构成细胞膜仿生修饰纳米片,该纳米递药系统保留了留BPNSs良好光热效应能力的同时,赋予该材料前列腺癌细胞膜的特异性抗原,使得该纳米递药系统具有抗免疫逃逸及肿瘤靶向的能力,以增强前列腺癌治疗效果。第二部分:在细胞层面探究硒掺杂黑磷化合物对前列腺癌细胞的抗增殖活性及其潜在作用机制,采用CCK-8、细胞侵袭和迁移实验以及检测其ROS活性氧的生成情况,最后采用流式细胞术进行验证其抗增殖活性。第三部分:在动物层面将药物向肿瘤部位递送,联合抗PD-1检查点阻断剂,探究硒掺杂黑磷化合物抗癌免疫治疗相关机制,通过血生化指标、药物的EPR效应以及肿瘤免疫细胞的流式检测(DC、Treg等细胞)进一步揭示其抗肿瘤活性的机制。实验结果:1、本研究采用气相沉积法结合液相超声剥离法成功制备出Se@BPNSs二维纳米薄片,构建一种新型的细胞膜仿生修饰纳米递药系统,即Se@BPNSs@RM-1。该材料尺寸约为100 nm左右。元素分析表明,Se成功掺杂到BP中。AFM结果证明,在掺Se后BP纳米片的尺寸相较于不掺Se,尺寸更加稳定在100 nm左右,二维纳米薄片的厚度没有发生改变,表明Se的引入能够稳定活泼的BP纳米片。从XRD晶体结构中看到,制备出的Se@BP二维纳米薄片具有与BP相似的晶体结构,表明Se掺杂不会改变黑磷纳米片稳定的层间结构。进一步的XPS实验表明,Se掺杂提高BP稳定性可能是由于,Se提供的电子空位与黑磷表面孤对电子发生氧化作用,BP中的P网络得以稳定。2、细胞层面对Se@BPNSs@RM-1的抗肿瘤活性进行了评价。结果表明,Se@BPNSs@RM-1可抑制肿瘤细胞的增殖活力,通过划痕试验、细胞侵袭实验,对前列腺癌细胞在各种给药方式下的转移能力进行了考察。结果表明,Se@BPNSs@RM-1能够抑制前列腺癌细胞的侵袭能力。另一方面借助流式细胞术,对前列腺癌细胞在各种给药方式下的死亡情况进行了考察,发现具有生物活性的Se@BPNSs@RM-1纳米片也表现出良好的抗侵袭活性。总的来说,Se@BPNSs@RM-1可有效抑制肿瘤细胞的增殖,并可以提高CRT以及HMGB1的含量,为后续动物实验的免疫治疗提供一定的指导意义。3、动物实验采用前列腺癌小鼠单侧瘤模型,对Se@BPNSs@RM-1的体内抗肿瘤活性进行了评价。借助小动物活体成像仪发现生物细胞膜包裹的硒掺杂黑磷复合物可以提高药物在荷瘤小鼠瘤体内的积累,有助于提高药物的靶向治疗作用。此外我们对肿瘤体内的Treg细胞以及淋巴结中的Treg和DC细胞进行了检测,发现Se@BPNSs@RM-1联合Anti-PD1以及激光组的Treg细胞表达量最低且DC细胞含量最高,这说明联合PD-1检查点阻断剂,能够进一步增敏其抗肿瘤活性,激发机体的免疫应答能够力。结论:1、成功设计合成并制备出Se@BPNSs@RM-1,并对其进行了一系列的表征实验已证实光热材料的成selleck产品功制备;2、Se@BPNSs@RM-1能够提高前列腺癌细胞活性氧水平,从而诱导肿瘤细胞的死亡,并释放一定量的CRT以及HMGB1,同时其ATP的活性也有所增强。借助流式细胞术,对前列腺癌细胞在各种给药方式下的DNA含量进行了考察。Se@BPNSs@RM-1可将前列腺癌细胞抑制在G0/G1期;3、动物实验结果表明,Se@BPNSs@RM-1可显著抑制肿瘤细胞的增殖,联合PD-1检查点阻断剂,能够进一步增敏其抗肿瘤活性,实现光热联合免疫治疗的作用;