研究背景及目的:念珠菌是一类常见的条件致病真菌,可以导致皮肤、黏膜、深部器官及血液等多处感染,这些疾病被统称为“念珠菌病”。目前,白念珠菌仍是临床检出率最高的念珠菌病病原体,正持续威胁着人们的健康。白念珠菌通常以酵母态定植于黏膜和皮肤表面,在一定条件下可以通过由酵母到菌丝的形态转换来提高自身毒力,加强对宿主的侵袭。与此同时,宿主免疫随之启动,用以清除感染。中性粒细胞是机体固有免疫的重要成员之一,能够通过吞噬、脱颗粒、产生活性氧JAK抑制剂、形成中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)等多种方式实现对白念珠菌的杀伤。然而,既往研究发现了一种奇怪的现象:在阴道白念珠菌感染中,高中性粒细胞水平仅仅对应了更显著的局部炎症,而未能降低真菌负荷。对此,研究人员建立了白念珠菌阴道黏膜感染小鼠模型并进行了一NSC 127716溶解度系列实验,最终发现局部环境中一定水平的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)能够抑制中性粒细胞对菌体的识别及杀伤。截至目前,上述实验结果尚未在人中性粒细胞与白念珠菌的相互作用中得到检验。HS是一种线性多糖,通常以硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan,HSPG)的形式广泛分布于细胞表面和细胞外基质(extracellular matrix,ECM),其中也包括了阴道局部环境。鉴于菌丝是白念珠菌致病的关键形态,要想控制感染必先保证对菌丝的有效杀伤,故而我们将关注点放在了白念珠菌菌丝、人中性粒细胞与HS三者之间。近年来多项研究证实,与能够被中性粒细胞吞噬杀灭的酵母不同,菌丝由于体积过大无法被吞噬,NETs介导的胞外杀伤是中性粒细胞将其清除的主要方式。因此,HS对中性粒细胞杀伤白念珠菌菌丝的影响或与NETs有关。为明确人体局部环境中中性粒细胞无法有效控制白念珠菌感染的原因,我们设计体外实验对HS在中性粒细胞杀伤白念珠菌菌丝中的影响及潜在机制进行探究。本课题拟提取健康人外周血中性粒细胞,检验该细胞对白念珠菌菌丝的体外杀伤活性,并评估HS干预对此的影响;同时体外诱导中性粒细胞释放NETs,检测NETs对白念珠菌菌丝的胞外杀伤,分别分析HS干DNA Sequencing预对NETs形成以及NETs胞外杀伤菌丝的影响,从而形成对其内在机制的初步探索。实验研究主要包括以下两个部分:第一部分 硫酸乙酰肝素对中性粒细胞体外杀伤白念珠菌菌丝的影响方法:1.抽取健康人外周血,以密度梯度离心法从中提取中性粒细胞。获得细胞悬液后,行瑞氏-吉姆萨染色以鉴别细胞类型,行台盼蓝染色进行活性分析,行流式细胞术检测进行纯度分析。2.将白念珠菌酵母诱导为菌丝态,以不同的比例关系与中性粒细胞进行共孵育,借助平板菌落计数法评估中性粒细胞对白念珠菌菌丝的杀伤活性,并选取适宜的MOI。3.在适宜MOI条件下的共孵育环境中,施加硫酸乙酰肝素这一干预,检验其对人外周血中性粒细胞体外杀伤白念珠菌菌丝的影响。结果:1.成功提取人外周血中性粒细胞,细胞活性良好,流式检测显示其纯度达99%以上。2.人外周血中性粒细胞在体外具有对白念珠菌菌丝的杀伤活性;当MOI=0.1时,其杀伤作用较为显著,故而该数值可作为适宜MOI在后续实验中选用。3.硫酸乙酰肝素对人外周血中性粒细胞体外杀伤白念珠菌菌丝具有抑制作用。第二部分 硫酸乙酰肝素通过抑制NETs形成从而减弱中性粒细胞对白念珠菌菌丝的体外杀伤方法:1.使用SYTOX Green染料对中性粒细胞与白念珠菌菌丝共孵育样本进行荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察其中的NETs结构,并通过扫描电子显微镜技术加以验证,明确以上NETs检测方法的可行性。2.分别以佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)与白念珠菌菌丝为刺激因素诱导中性粒细胞释放NETs,设置不加刺激因素的对照组,同时在各组内设置加HS与不加HS两个亚组,分别进行组内比较和组间比较,分析HS对NETs释放过程产生的影响。3.以PMA为诱导剂刺激中性粒细胞释放NETs,加入适量的白念珠菌菌丝,借助平板菌落计数法比较加HS与不加HS两组间的菌量差异,分析HS对已释放至胞外的NETs发挥菌丝杀伤作用的影响。结果:1.白念珠菌菌丝可在体外诱导人外周血中性粒细胞释放NETs;单一使用SYTOX Green染料进行荧光染色即可实现对NETs结构的定位。2.相同条件下作用3h后,白念珠菌菌丝与PMA的NETs诱导能力基本相当;HS可抑制菌丝诱导下的NETs形成,但对PMA的NETs诱导能力无影响。3.HS对已释放至胞外的NETs发挥菌丝杀伤作用无影响。结论:硫酸乙酰肝素通过抑制白念珠菌菌丝诱导下的NETs形成,从而削弱了人外周血中性粒细胞对菌丝的体外杀伤活性。