研究背景:非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)是指由多种致病因素如病毒和细菌感染、自身免疫、肥胖,代谢等诱因使肝脏细胞受到破坏,肝脏功能受损并引起身体一系列不适症状的临床疾病。病理学特点表现为不同程度的脂肪浸润和炎症反应,随后发生肝纤维化,最终可发展为肝硬化,甚至肝癌。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)是一种专性厌氧的革兰氏阴性杆菌,是目前公认的最重要的牙周炎致病菌之一。P.g可引起口腔微环境紊乱并引起一系列牙周疾病。P.g也可致使肠道微环境紊乱诱发肠道炎症并破坏肠道屏障使自身毒力因子进入血液循环从而导致NASH的发生以及消化系统疾病的恶化。同时,在P.g直接引起的NASH中,P.g导致肝细胞NF-κB信号通路激活使肝细胞发生炎症反应。然而,肝脏炎症反应增强可导致ROS增多,氧化应激增强从而引发肝细胞铁死亡。因此,探究P.g通过NF-κB信号通路调控肝细胞发生铁死亡在非酒精性脂肪性肝炎中的作用和机制具有一定的研究价值,并且阐明牙周疾病菌与NASH之间的关系,为后期通过治疗牙周炎来缓解或者预防NASH提供理论依据,为NASH治疗提供新的思路和策略。研究目的:通过体内外实验分析P.g通过激活NF-κB信号通路调控肝细胞发生铁死亡在非酒精性脂肪性肝炎中的作用和分子机制。研究方法:动物模型造模方法:实验组给BALB/C小鼠灌饲量约1×109的P.g,对照组给予相同量的BHI细菌培养基。在实验期间,每组小鼠每周称重一次,并监测其存活率。在第三,五周结束时,通过眼眶后静脉丛收集200μL的血液。在第七周灌饲后,收集血液、粪便,肝脏,脾脏,上颌骨,肠道器官。体内牙周,肠道和肝脏损伤实验:收集的血液测定肝功能生化指标ALT、AST评估肝脏功能;粪便采用16Sr RNA测序分析肠道菌群紊乱程度;H&E染色及免疫组化评估肝脏和肠道炎症浸润程度以及牙周炎症浸润情况和牙槽骨吸收情况。免疫组化分析肝脏和肠道中铁死亡相关调控蛋白(GPX4,ACSL4,SLC7A11)的变化;RT-PCR检测肝脏中铁死亡相关基因(Gpx4,Ptgs2,Ncoa4)的m RNA表达变化;Western blot分析肝组织蛋白中铁死亡相关调控蛋白的变化;RT-PCR检测肝脏中P.g菌特异性蛋白酶(Kgp,Rgp A,Rgp B)的m RNA表达变化;Western blot分析肝组织蛋白中NF-κB信号通路关键蛋白的表达水平。肝细胞损伤模型体外实验:将L-02细胞系与26.7%的P.g菌培养上清共培养24h,通过CCK-8和细胞活死染色分析P.g对肝细胞活力的影响;收集肝细胞RNA和蛋白后,RT-PCR检测肝细胞中铁死亡相关基因(GPX4,PTGS2,NCOA4)的m RNA表达变化,Western blot分析肝细胞蛋白中铁死亡相关调控蛋白(GPX4,ACSL4,SLC7A11)的变化,并分析肝细胞蛋白中NF-κB信号通路激活情况(NF-κB-p65,p-NF-κB-p65,IKBα)以及肝细胞炎症因子的表达情况(IL-17,IL-6,IL-10);并通过Western blot分析NF-κB入核情况;采用铁死亡抑制剂(Fer-1)浓度为5μmol/m L作用肝细胞2h后,在与26.7%的P.g菌培养上清共培养24h,评估细胞活力收集肝细胞RNA和蛋白,RT-PCR检测肝细胞中铁死亡相关基因(GPX4,PTGS2,NCOA4)的m RNA表达变化,Western blot分析Intrapartum antibiotic prophylaxis肝细胞蛋白中铁死亡相关调控蛋白(GPX4,ACSL4,SLC7A11)的变化;采用NF-κB信号通路抑制剂(QNZ)浓度为30 nmol/m L处理肝细胞2h后,在与26.7%的P.selleck PF-02341066g菌培养上清共培养24h,收集肝细胞RNA和蛋白,RT-PCR检测肝细胞中铁死亡相关基因(GPX4,PTGS2,NCOA4)的m RNA表达变化,Western blot分析肝细胞蛋白中铁死亡相关调控蛋白(GPX4,ACSL4,SLC7A11)的变化以及NF-κB信号通路(NF-κB-p65,p-NF-κB-p65,IKBα)的表达情况及肝细胞炎症因子(IL-17,IL-6,IL-10)的表达。研究结果:1.免疫组化及H&E染色可知小鼠牙槽骨吸收,牙周IL-17和IL-6的表达升高,提示P.g菌灌饲可造成小鼠牙周炎症;16Sr RNA测序结果发现小鼠经P.g灌饲后肠道微环境紊乱表现为拟杆菌群增加,厚壁菌群减少;肠道炎症反应增加以及绒毛间质水肿并发生铁死亡;肠道屏障改变后并发现P.g菌及其特异性蛋白Kgp,Rgp A,Rgp B在肝脏中表达,提示P.g菌可能定植于肝脏中;2.小鼠灌饲P.g菌7周后,血清学检测分析ALT、AST水平升高;H&E染色结果展示33.33%的小鼠肝脏发生脂肪性病变,100%小鼠肝脏出现大量炎症细胞浸润,提示P.g菌灌饲可造成小鼠NASH发生;3.P.g导致肝细胞发生炎症反应并激活NF-κB信号通路:免疫组化证实肝脏和脾脏组织中炎症因子的表达增加;Western blot和RT-PCR得知肝脏组织中炎症因子表达增加以及NF-κB信号通路激活;免疫荧光染色可见肝脏中NF-κB表达增强;体外实验证实NF-κB信号通路抑制剂QNZ可抑制NF-κB信号通路的激活并缓解由P.g引发的肝细胞炎症反应;4.P.g导致肝细胞发生铁死亡:免疫组化证实肝脏组织中铁死亡典型调控蛋白GPX4和SLC7A11表达减少,ACSL4表达增加;Western blot结果表明肝脏组织中铁死亡调控蛋白GPX4和SLC7A11表达减少,ACSL4表达增加;RT-PCR得知肝脏组织中铁死亡调控基因Gpx4的m RNA表达水平降低,Ptgs2和Ncoa4的m RNA表达水平增高,提示P.g灌饲后导致肝细胞发生铁死亡;体外实验通过使用铁死亡抑制剂Fer-1可缓解由P.g上清引起的肝细胞活性,铁死亡和炎症反应;5.NF-κB信号通路抑制剂QNZ可抑制由P.g上清引起的肝细胞铁死亡和炎症反应:Western blot结果表明铁死亡蛋白ACSL4的表达被QNZ抑制,并且QNZ有效的缓解GPX4和SLC7A11的表达水平;RT-PCR结果可知GPX4的m RNA水平被QNZ缓解,PTGS2和NCOA4的m RNA水平被QNZ抑制;Western blot结果表明QNZ抑制炎症因子IL-17,IL-6的表达,增加IL-10抗炎因子的表达。研究结论:1.体内研究证实通过灌饲P.g菌可导致牙周炎症和肠道炎症及铁死亡发生并导致肠微环境紊乱,发现P.g菌可能在肝脏中发生定植;2.体内研究发现通过灌饲P.g菌可直接导致肝脏功能损伤、肝脏炎症反应和脂肪性病变;体内研究证实P.g激活小鼠肝脏中NAMG510体内F-κB信号通路,体外研究证实P.g上清可激活NF-κB信号通路;进一步体外研究发现P.g上清可影响肝细胞活力及炎症反应并致使肝细胞发生铁死亡,并且体外通过铁死亡抑制剂可缓解铁死亡的发生;3.体外研究发现通过使用NF-κB信号通路抑制剂QNZ可抑制由P.g上清引起的肝细胞铁死亡并缓解肝细胞炎症反应,抑制促炎因子的表达。这表明P.g菌通过激活NF-κB信号通路致使肝细胞发生炎症反应进一步促进铁死亡的发生。图17表14参65