目的:通过对4例植物固醇血症先证者血清植物固醇浓度的检测、家系调查及基因测序,明确先证者的基因缺陷特点及家系遗传特点。对一例ABCG8基因内含子突变的致病机制进行研究。方法:第一部分:收集4例先证者的临床资料,同时进行家系调查。采集先证者的外周血,进行血清植物固醇浓度检测,同时提取外周血基因组DNA,通过基因测序,明确致病基因突变位点,并对家系成员进行基因突变验证。第二部分:采用Minigene技术对其中一例先证者ABCG8基因c.322-2A>G突变进行致病性分析。明确内含子突变对RNA剪接的影响后,通过真核表达载体验证ABCG8基因c.322-2A>G突变对蛋白的影响。结果:第一部分:1、本研究共诊断4例植物固醇血症患者,2例患者父母为近亲婚配。4例先证者血常规均有贫血及血小板减少,网织红细胞升高,有溶血性贫血的表现。外周血涂片提示其中4例可见口形红细胞,3例患者见巨大血小板;4例先证者均有脾大,其中3例可见胆红素及转氨酶轻度升高,有2例患者有心血管累及,有1例患者出现了黄色瘤;4例患者骨髓细胞学提示均为增生明显活跃,红系明显升https://www.selleck.cn/products/ABT-263.html高,粒红比倒置,巨核细胞均增生活跃,未见明显病态造血;后期随访中有1例患者死于肝功能衰竭。4例患者血清菜油固醇、β-谷固醇的含量明显升高,其中3例可见豆固醇含量轻度升高。2、在PCR扩增及全外显子测序中,病例1发现了2个致病突变,即ABCG5基因中c.64C>T:p.Q22X及c.1336C>T:p.R446X的突变。病例2发现了3个致病突变,为ABCG8基因中c.A1732T:p.I578L、c.G1720A:p.G574R及c.T1621C:p.C541R突变。病例3发现了1个致病突变,为ABCG5基因中c.1336C>T:p.R446X:纯合无义突变。病例4发现了1个致病突变,为ABCG8基因c.323-2A>G纯合突变。经数据库检索ABCG8基因c.A1732T:p.I578L、c.T1621C:p.C541R突变及c.323-2A>G突变均为新发突变。第二部分:1、我们使用pc MINI和pc MINI-C两套载体,采用Minigene技术对病例4ABCG8基因c.323-2A>G突变进行转录后剪接方式的验证,结果发现c.322-2A>G突变会影响基因m RNA的正常剪接,且pc MINI和pc MINI-C两套载体的检测结果一致,都会导致Exon4跳跃,整个Exon4同时被剪切掉,蛋白翻译时将产生移码突变,在后续第10个氨基酸位置形成终止密码,其在c DNA及蛋白水平的表示方式为:c.323＿561delIACS-10759采购239bp p.Cys109Glyfs*10。2、在体外经Phage及GFP系列真核细胞表达载体中,ABCG8基因c.322-2A>G突变后导致HA-ABCG8-Flag及GFP-ABCG8 m RNA水平和融合蛋白水平表达量均显著下调。结论:1、本研究诊断的4例植物固醇血症患者,1例患者有典型的黄色瘤,2例患者伴有心血管累及,4例均有溶血性贫血及血小板减少;3例患者出现肝功能异常,外周血涂片可见巨大血小板、口形红细胞;骨髓细胞学均未见明显的病态造血等异常。4例患者血清植物固醇浓度(菜油固醇、β-谷固醇)均显著升高。2、通过基因测序,4例患者共发现了6个致病性突变,ABCG5、ABCG8均有,其中2个无义突变(ABCG5基因c.64C>T:p.Q22X和c.1336C>T:p.R446X突变),3个错义突变(ABCG5基因c.T1621C:p.C541R突变,ABCG8基因c.A1732T:p.I578L、c.G1720A:p.G574R突变),1个内含子突变(ABCG8基因c.323-2A>G突变)。其中经数据库检索,ABCG8基因c.A1732T:p.I578L、c.T1621C:p.C541R突变及c.323-2A>G突变均为新发突变。3、ABCG8基因c.323-2A>G纯合突变将导致ABCG8基因外显子4在转录后的剪接过程中被剪切掉(c.3Mendelian genetic etiology23＿561del239bp),在第5外显子中产生提前的终止密码子(p.Cys109Glyfs*10),最终导致疾病的发生。4、临床上对于出现黄色瘤、早发性冠心病、不明原因肝功能异常、溶血性贫血、口形红细胞、巨大血小板的患者应考虑植物固醇血症可能,需积极进行血清植物固醇浓度以及基因检测。