近些年来乳腺癌发病率逐年升高,尽管随着医疗手段的不断提高,能够在一定程度上减少乳腺癌死亡患者的数量。但是并不能完全应对现有治疗手段以及化疗药物所引发的不良反应及其毒副作用的产生。人们在对中药提取的研究上发现许多提取物具有良好的治疗效果以及低毒副作用等优点。因此,从中药提取物中开发筛选具有良好抑瘤效果的活性成分,成为解决现有化疗药物高毒副作用问题的一种应对方法。大苞藤黄(Garcinia bracteata C.Y.Wu)为藤黄科藤黄属植物,主要活性成分为笼状呫吨酮类化合物,具有良好的抗肿瘤活性。本试验以提取自大苞藤黄中的活性成分Neobractatin(NBT)为研究对象,体外试验模型选用EMT6小鼠乳腺肿瘤细胞,体内试验通过建立EMT6小鼠乳腺癌移植瘤模型,对NBT的抑瘤效果及安全性进行初步探究。旨在为NBT作为新型抗乳腺肿瘤药物的开发提供理论基础,为中药提取物活性成分作为高效低毒的绿色抗肿瘤新兽药的深入开发与应用奠定理论基础。试验方法上,体外选用CCK-8、平板克隆试验来对NBT抑制EMT6细胞增殖的能力进行评价;对NBT可能诱导的死亡方式采取形态学观察、线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、乳酸脱氢酶释放量(Lactate dehydrogenase,LDH)、流式细胞术检测细胞周期、凋亡试验来进行初步研究;抑瘤机制上结合转录组测序进行分析,同时应用实时荧光定量PCR以及免疫蛋白印迹法(Western Blot,WB)进行进一步的研究。在体内模型抑瘤效果的探究上,以天然化疗药物紫杉醇(Paclitaxel,PTX)为阳性对照,通过建立EMT6小鼠乳腺癌移植瘤模型,以NBT(MK-2206说明书5 mg/kg)的剂量腹腔给药14 d,收样后对比结合移植瘤生长曲线、外观、质量、抑瘤率、病理切片数据进行体内模型抑瘤效果的评价;在对NBT药物的安全性探究上,采用生化试剂盒检测移植瘤小鼠AST、ALT、Cr、BUN的血清含量,同时结合移植瘤小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏器官指数、病理切片进行初步评价。主要研究结果如下:(1)体外试验研究中,CCK-8以及平板克隆试验结果显示,NBT对EMT6细胞活力以及克隆形成能力具有时间依赖性抑制作用,初步说明NBT能够抑制EMT6小鼠乳腺肿瘤细胞的增殖。形态学观察结果显示NBT能够诱导EMT6细胞肿胀、细胞质内空泡化以及质膜表面气泡的形成,以浓度依赖性极显著(P<0.01)诱导EMT6细胞LDH释放以及细胞内ROS的生成,在高浓度3.6μM时极显著(P<0.01)降低MMP。流式细胞术检测细胞周期及凋亡结果显示,NBT能够诱导EMT6细胞G_1/S期阻滞以及早期凋亡的发生。转录组测序结果分析发现差异基因主要集中富集在TNF、MAPK等信号通路上。通过q PCR检测结果表明NBT显著(P<0.05)升高坏死性凋亡相关因子TNF-α、RIPK1、RIPK3、MLKL的m RNA表达水平,极显著(P<0.01)降低Caspase-8的m RNA表达水平。WB结果显示,NBT作用于EMT6细胞后极显著(P<0.01)升高了TNF-α、RIPK1、RIPK3、MLKL的蛋白表达量,极显著(P<0.01)降低了Caspase-8的蛋白表达量。推测NBT可能通过诱导TNF-α、RIPK1、RIPK3、MLKL的表达,进而导致坏死性凋亡的发生。而Caspase-8的低表达在功能上可能进一步抑制凋亡和焦亡的发生。(2)体内试验研究中,小鼠体重曲线图、移植瘤生长曲线、瘤重结果数据显示,NBT(5 mg/kg)腹腔给药对移植瘤小鼠的精神状态及体重无明显影响,与MOD组相比,NBT(5 mg/kg)能够极显著(P<0.01)抑制小鼠移植瘤的生长。H&E染色结果显示,NBT(5 mg/kg)组肿瘤细胞以及血管数量相对减少,溶解、坏死的细胞比例增多。抑瘤率结果显示,NBT(5 mg/kg)组移植瘤抑制率为49.12%,能够近乎达到与PTX相同的抑制效果。移植瘤组织中坏死性凋亡相关因子的mRNA及蛋白表达量变化结果显示,与MOD组相比,NBT(5 mg/kg)极显著(P<0.01)升高TNMarine biologyF-α、RIPK1、RIPK3、MLKL的表达量,极显著(P<0.01)降低了Caspase-8的表达量,与体外模型上试验的结果相一致。除此之外,各器官指数以及H&E染色结果显示,NBT(5 mg/kg)给药后对小鼠体内各器官无明显的毒副作用,与MOD组相比,NBT能够极显著(P<0.01)降低移植瘤小鼠血清内的Cr含量,使其恢复至健康水平,对肾脏具有一定的保护作用。结论:(1)NBT能够在体外抑制EMT6小鼠乳腺癌细胞的增殖,在体内抑制移植瘤的生长,且能够近乎达到与天然化疗药物紫杉醇相同的抑瘤Belumosudil体内实验剂量效果。(2)NBT能够在体内外通过引起TNF-α、RIPK1、RIPK3、MLKL的过量表达,进而导致EMT6小鼠乳腺癌细胞坏死性凋亡的发生,坏死性凋亡的发生可能是NBT抗乳腺肿瘤的潜在治疗靶点。(3)NBT能够降低移植瘤小鼠血清中的肌酐水平,使其恢复至健康状态,对肾脏具有一定的保护作用,且对其他主要器官无明显的毒副作用,是一种低毒副作用的良好抗肿瘤候选药物。