背景:空气污染是全球性的公共卫生问题。在过去几十年里,人们越来越重视环境空气质量。空气污染物成分组成复杂,空气污染会给人们带来长期的危害。人们通过呼吸系统以及皮肤接触到空气污染物,进而导致机体相关疾病风险增加。研究表明,高浓度的空气污染物会导致intramammary infection地区的肺部和心血管疾病高发,影响当地居民的健康,增加疾病负担。NO_2作为当前主要空气污染物,是颗粒物和臭氧的前体,其高浓度暴露会刺激人体呼吸道,并且会导致酸雨的出现。近年来,人为大量使用燃料和排放废气,导致NO_2污染日益严重。世界卫生组织空气质量数据库在2022年的更新中首次引入了二氧化氮年平均浓度的地面测量结果,结果显示只有23%地区的人群吸入的NO_2年平均浓度符合世卫组织空气质量标准。此外,使用燃气和固体燃料取暖的城市和地区以及交通发达的城市和地区的NO_2浓度水平非常高。NO_2和其他空气污染物可导致肺部疾病发生率和癌症死亡率上升,NO_2会对人群造成不良健康效应以及会加重呼吸系统和心血管系统的疾病负担,比如哮喘、缺血性心脏病等,研究表明NO_2暴露与儿童哮喘的发生有关,还与过敏原有协同作用。且目前对于NO_2的体内和体外研究表明,NO_2可使空气传播的假单胞菌细胞形态改变,还可增加哮喘患者的呼吸道炎症。哮喘小鼠模型显示,在NO_2暴露下,变应原诱导的气道反应性延长,嗜酸性呼吸道炎症增加,并产生炎症反应。此外,暴露在NO_2中的啮齿动物会出现心血管问题,血液中也会出现氧化-抗氧化失衡现象。铁死亡是一种NSC 119875供应商新型的细胞程序性死亡方式,最近研究表明,铁死亡普遍存在于各种生理和病理现象中,比如炎症、免疫反应等,在最新关于癌症的研究中也常常使用铁死亡机制来诱导癌细胞死亡。不同的氧化和抗氧化途径将自噬和膜修复结合在一起,从而导致铁死亡过程中的脂质过氧化和质膜损伤。铁死亡的启动需要抑制抗氧化酶SLC7A11-GSH-GPX4系统和游离铁的积累,脂质过氧化发生会导致过氧化氢增加,且其次级产物直接或间接地在质膜或细胞器膜上形成孔,最终触发细胞铁死亡。目的:本研究将大气污染物NO_2的人群健康效应和体外试验相结合,探究NO_2所带来的人群健康效应及其急性毒作用机制,为后续空气质量标准的制定以及为大气污染防控提供科学依据,并为广州市医疗资源的流动和分布起到一定的指示作用。方法:1.广州市NO_2及其他大气污染物污染状况和对人群的健康效应分析(1)收集2015-2019年广州市五种大气污染物的日均污染浓度数据、气象数据、门诊就诊数据和居民每日死亡数据,进行质量控制后,分别对数据进行描述性分析,以探究广州市五种大气污染物的污染状况。使用spearman分析对五种大气污染物和气象数据进行相关性分析。采用卡方检验对居民每日死亡数据进行分层分析。(2)使用广义相加模型以及分布滞后效应模型对大气污染物浓度分别与门诊和居民每日死亡数据进行联合分析,以探究大气污染物与人群健康效应影响分析。2.大气污染物NO_2对人肺支气管上皮(Beas-2B)细胞的毒性效应分析(1)建立NO_2体外急性染毒模型:使用气液界面暴露系统(ALI)将Beas-2B细胞连续3天暴露在不同浓度的NO_2中,每天暴露0.5 h,对照组细胞暴露于空气中。将细胞接种于6孔板Transwell板上,将细胞放置于三联管中进行暴露,三联管下方注入培养基,使细胞一面接触培养基一面接触气体。不同浓度的NO_2由50 ppm NO_2和空气以不同流速混合而成。使用细胞温育系统将细胞保持在37℃。(2)细胞活力和凋亡率检测:采用CCK-8法检测NO_2暴露对Beas-2B细胞的活力影响。使用凋亡试剂盒检测NO_2暴露对Beas-2B细胞凋亡率的影响,以评价NO_2对细胞生长状态的影响。(3)细胞氧化损伤检测:使用ROS、MDA和SOD试剂盒检测NO_2暴露对Beas-2B细胞ROS、MDA含量和SOD活力的影响,以评价NO_2对细胞产生氧化损伤的情况;(4)细胞炎症反应检测:使用q RT-PCR试验检测NO_2暴露对Beas-2B细胞内IL-6、IL-8、TNF、IL-1A、IL-1B和CP-1的表达情况;使用ELISA试验检测Beas-2B细胞IL-6的蛋白表达情况,以评价NO_2造成细胞炎症反应的程度。(5)细胞遗传毒性检测:使用彗星实验检测NO_2对于Beas-2B细胞DNA损伤作用,以探讨NO_2的遗传毒性。3.大气污染物NO_2造成人肺支气管上皮细胞损伤机制研究(1)转录组测序分析:使用全长转录组测序技术对NO_2暴露后的Beas-2B细胞进行研究,然后对差异表达基因进行KEGG通路富集分析,以探究NO_2导致Beas-2B细胞损伤的机制。(2)线粒体形态观察:使用透射电镜(1000X、5000X)观察NO_2暴露对Beas-2B细胞线粒体形态的影响。(3)细胞铁离子水平检测:使用铁离子试剂盒检测NO_2暴露对Beas-2B细胞内铁离子含量的影响。(4)铁死亡相关基因检测:使用q RT-PCR试验来验证NO_2暴露后的Beas-2B细胞内铁离子相关基因的表达情况,探讨NO_2致铁死亡的分子机制。(5)RNA干扰实验验证:q RT-PCR试验检测STEAP3基因的敲低效率。(6)氧化损伤检测:通过RNA干扰实验敲低STEAP3探究NO_2暴露Beas-2B细胞ROS、MDA含量和SOD活力变化。(7)铁离子水平检测:通过RNA干扰实验敲低STEAP3探究NO_2暴露Beas-2B细胞铁离子含量变化。结果:1.广州市2015-2019年NO_2年平均浓度为45μg/m~3,超过我国空气质量标准(40μg/m~3)。2.NO_2可导致呼吸系统就诊相对风险增加,RR为1.01(1.00,1.01),主要导致急性上、下呼吸道感染就诊相对风险增加,且随着滞后天数增加,累积相对风险增强;其他大气污染物(SO_2、O_3、PM_(2.5)和PM_(10))均导致呼吸系统就诊相对风险增加。3.NO_2可使癌症死亡的累积相对风险增加,且女性比男性更敏感,RR分别为1.02(1.01,1.03),1.02(1.01,1.03);NO_2可导致使肺癌死亡的累积相对风险增加,其效应在男性中更为显著,RR为1.03(1.01,1.05);SO_2、O_3、PM_(2.5)和PM_(10)会使癌症死亡和肺癌死亡的累积相对风险增加。4.NO_2可造成Beas-2B细胞的细胞活力下降(P<0.05)和细胞GSK126化学结构凋亡率上升(P<0.01)。5.NO_2可造成Beas-2B细胞氧化损伤,氧化产物活性氧(ROS)含量(P<0.01)、丙二醛(MDA)含量(P<0.05)上升和抗氧化物酶(SOD)活力下降(P<0.01)。6.NO_2可引起Beas-2B细胞发生炎症反应,炎性因子IL-6(P<0.05)、IL-8(P<0.05)、TNF(P<0.05)、IL-1A(P<0.05)、IL-1B(P<0.01)和炎症小体CP-1(P<0.01)的m RNA表达增加,同时也会使IL-6的蛋白表达增加(P<0.01)。7.NO_2可导致Beas-2B细胞DNA损伤,细胞尾部DNA%、尾部长度和Oliver尾矩显著增加(P<0.05)。8.测序结果显示NO_2暴露导致Beas-2B细胞毒性效应与铁死亡通路有关。9.NO_2可导致Beas-2B细胞的线粒体变小、线粒体膜密度增加、线粒体嵴减少。10.NO_2暴露引起Beas-2B细胞内铁离子含量上升,提示发生铁离子聚集(P<0.01)。11.NO_2可造成Beas-2B细胞内铁离子相关基因差异表达,STEAP3和ACSL4基因表达水平升高(P<0.05),FTH1、GPX4和SLC7A11基因表达水平降低(P<0.05)。12.敲低STEAP3会减少NO_2暴露Beas-2B细胞的ROS、MDA含量和增加SOD活力,提示敲低STEAP3可减轻NO_2导致Beas-2B细胞氧化损伤。13.敲低STEAP3会减少NO_2暴露Beas-2B细胞内铁离子含量。结论:1.广州市NO_2年平均浓度和24小时最大日均浓度超过国家空气质量标准,提示NO_2污染在广州相对严重。2.广州市NO_2和其他大气污染物浓度增加可导致居民呼吸门诊就诊风险增加,癌症和肺癌死亡的风险增加,提示NO_2会对广州市居民健康造成影响。3.NO_2可导致人肺支气管上皮细胞Beas-2B细胞发生氧化损伤、急性炎症反应以及DNA损伤,提示NO_2具有细胞毒性和遗传毒性。4.NO_2引起人肺支气管上皮Beas-2B细胞线粒体损伤,铁离子累积,提示NO_2诱导的细胞毒性可能与铁死亡相关,并且STEAP3可能参与细胞铁死亡。