脓毒症是机体对感染的免疫反应失调所致的危及生命的器官功能障碍~([1-3])。脓毒症后血管屏障功能障碍,微循环血量减少是导致器官功能障碍的重要原因~([4,5])。尽管近年来脓毒症的治疗发展迅速,但临床针对脓毒症血管渗漏仍缺乏有效的治疗手段。因此,寻找脓毒症所致血管屏障功能障碍的有效治疗措施,对降低脓毒症患者死亡率具有重要意义。周细胞是间充质来源的壁细胞,位于肺和全身毛细血管的基底膜内,周细胞呈放射状与多个内皮细胞相连,发挥结构支持作用,同时周细胞还控制血管张力,产生细胞外基质成分,以及促进血管稳态和血管生成的细胞因子~([6,7])。周细胞在肺血管内皮细胞上的覆盖率对肺血管屏障功能起着决定性作用~([5,8,9])。我们前期实验发现脓毒症后周细胞大量脱落,但周细胞损伤机制如何目前尚不清楚。铁死亡是一种新的细胞程序性死亡,其特征是铁依赖性的脂质过氧化物蓄积;研究发现铁死亡与多种疾病的发生密切相关,包括脓毒症~([10])。铁死亡细胞可释放损伤相关分子模式和脂质过氧化物,进一步加重脓毒症炎症反应~([11]);铁螯合剂可抑制脓毒症进展,提高脓毒症小鼠存活率和延长存活时间~([12]);铁死亡抑制剂可减轻脓毒症后器官功能障碍和炎症反应~([13])。脓毒症后周细胞是否以铁死亡的方式脱落,抑制周细胞铁死亡能否减轻脓毒症后肺血管渗漏,目前尚不清楚。据此,本研究采用盲肠结扎穿孔术复制脓毒症大鼠模型,以及脂多糖(LPS)处理周细胞建立脓毒症细胞模型;采用蛋白组学、代谢组学、周细胞靶向脂质体构建、腺病毒RNAi干扰、流式细胞术、免疫荧光、透射电镜、WB、检测血管内皮细胞跨膜电阻率(TER)及荧光白蛋白(Fluoresceine Isothiocyanate-Bovine Serum Albumin,FITC-BSA)透过率,检测肺血管对FITC-BSA和伊文思蓝(Evens Blue,EB)透过率等方法分别从整体及离体水平研究周细胞铁死亡在脓毒症后肺血管屏障功能障碍中的作用及机制。【研究内容】第一部分脓毒症后周细胞数量减少与血管渗漏的关系利用盲肠结扎穿孔术复制脓毒症大鼠模型,以肺血管为研究对象。研究脓毒症大鼠肺血管周细胞数量减少与血管渗漏的关系。采用免疫荧光和WB观察脓毒症大鼠肺血管周细胞数量的变化;采用肺血管对EB和FITC-BSA的透过率观察脓毒症肺血管屏障功能的变化;采用透射电镜观察内皮细胞间紧密连接结构的变化。第二部分周细胞铁死亡在脓毒症后肺血管渗漏中的作用1.细胞水平研究LPS处理周细胞,周细胞铁死亡情况及铁死亡抑制剂Fer-1对周细胞的保护作用。按文献方法提取视网膜周细胞~([14]),采用免疫荧光鉴定提取的原代周细胞。在细胞水平采用铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1,Fer-1)预处理周细胞后再采用LPS刺激周细胞,观察LPS处理周细胞铁死亡情况及Fer-1对周细胞的保护作用;检测各组细胞内Lipid ROS、亚铁离子(Fe~(2+))、脂质过氧化物(LPO)、还原型谷胱甘肽(GSH)含量变化,还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比值(GSH/GSSG)变化和铁死亡相关蛋白COX2和GPX4表达变化。将周细胞与血管内皮细胞共培养,利用TER和FITC-BSA透过率观察Fer-1预处理周细胞对脓毒症血管内皮细胞通透性的影响。2.整体水平研究脓毒症大鼠肺血管周细胞铁死亡情况及Fer-1对周细胞的保护作用盲肠结扎穿孔术前经腹腔注射Fer-1,以肺血管为研究对象。流式细胞术观察Fer-1对脓毒症大鼠肺血管周细胞内Lipid ROS含量的影响。观察Fer-1对脓毒症大鼠肺血管周细胞数量的影响:免疫荧光观察肺血管内皮细胞上周细胞覆盖率的变化和检测肺血管周细胞标志物PDGFR-β和NG2表达的变化。观察Fer-1对脓毒症大鼠肺血管铁死亡的影响:检测肺血管铁死亡相关蛋白GPX4和COX2表达和肺血管内LPO含量的变化。3.Fer-1对脓毒症大鼠肺血管屏障功能和肺功能的保护作用盲肠结扎穿孔术前经腹腔注射Fer-1,以肺血管为研究对象。观察Fer-1对脓毒症大鼠肺血管屏障功能的影响:检测肺血管对EB和FITC-BSA透过率和肺血管内皮细胞超微结构的变化。观察Fer-1对肺病理结构和功能的影响:检测肺组织中性粒细胞浸润情况、肺湿干质量比和动脉血气各项指标的变化。第三部分脓毒症周细胞铁死亡的机制1.蛋白组学联合代谢组学寻找介导脓毒症周细胞铁死亡的关键分子蛋白组学联合代谢组学分析发现脓毒症周细胞发生代谢重编程,脂代谢严重紊乱。蛋白组学提示脓毒症周细胞Acyl-Co A合成酶长链家族成员4(Acyl-Co A Synthetase Long Chain Family Member 4,ACSL4)显著上调,ACSL4既是铁死亡的关键执行分子,又是脂代谢调节分子,据此本实验研究ACSL4介导脓毒症周细胞铁死亡的机制。2.调控周细胞ACSL4表达对脓毒症周细胞铁死亡的影响利用腺病毒RNAi干扰的方法建立周细胞ACSL4敲低模型,观察敲低周细胞ACSL4表达水平对脓毒症周细胞铁死亡的影响:检测周细胞活性、周细胞内Lipid ROS和LPO含量的变化,检测周细胞铁死亡相关蛋白COX2和GPX4表达的变化。3.ACSL4调控脓毒症周细胞铁死亡的机制利用腺病毒RNAi干扰的方法建立周细胞ACSL4敲低模型,观察敲低周细胞ACSL4表达水平对脓毒症周细胞线粒体功能的影响:检测线粒体膜电位、线粒体呼吸功能和线粒体内ROS含量变化。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α(PPARγ-coactivator-1,PGC-1α)是促进线粒体增殖和增加线粒体氧化功能的重要蛋白,检测敲低周细胞ACSL4表达水平对脓毒症周细胞PGC-1α表达的影响。4.YAP1调控脓毒症周细胞ACSL4的机制Hippo通路能感知多种外界刺激,并通过蛋白激酶链磷酸化Yes相关蛋白1(Yes-associatedprotein1,YAP1)导致其胞质滞留和降解。非磷酸化形式的YAP1可进入细胞核结合转录因子激活靶基因发挥转录调控作用。蛋白组学提示脓毒症周细胞内Hippo通路显著下调,据此本实验研究了YAP1与脓毒症周细胞ACSL4表达的关系。观察脓毒症周细胞YAP1表达水平及核转位情况的变化,利用腺病毒RNAi干扰的方法建立周细胞YAP1敲低模型,观察敲低周细胞YAP1表达水平对脓毒症周细胞ACLS4表达和细胞活性的影响。第四部分靶向调控周细胞ACSL4表达对脓毒症大鼠肺血管屏障功能和重要脏器功能的保护作用1.调控周细胞ACSL4表达对脓毒症血管内皮细胞通透性的影响利用腺病毒RNAi干扰的方法建立周细胞ACSL4敲低模型,将周细胞与血管内皮细胞共培养,采用TER和FITC-BSA透过率明确敲低周细胞ACSL4表达对脓毒症血管内皮细胞通透性的影响。2.载罗格列酮(Rosiglitazone,Rosi)及靶向周细胞脂质体(Rosi@LNP-aminopeptidase A/NG2)的制备及理化性质评价采用薄膜分散法利用PEG化脂质体对ACSL4抑制剂Rosi进行包载,构建靶向周细胞表面标志物NG2和aminopeptidase A的靶向肽负载于脂质体表面,制备了靶向周细胞的脂质体Rosi@LNP-aminopeptidase A/NG2。利用透射电镜和DLS对脂质体形貌进行表征,检测脂质体粒径、电位、载药量和包封率等;同时检测脂质体在pH7.4的PBS溶液中的释放曲线;采用免疫荧光检测脂质体的周细胞靶向性。3.Rosi@LNP-aminopeptidase A/NG2对脓毒症大鼠肺血管周细胞的保护作用盲肠结扎穿孔术前经尾静脉注射脂质体(Rosi 0.2mg/kg),以肺血管为研究对象。采用流式细胞术观察周细胞靶向脂质体对脓毒症大鼠肺血管周细胞内Lipid ROS含量的影响;观察周细胞靶向脂质体对脓毒症大鼠肺血管周细胞数量的影响:采用免疫荧光检测脓毒症大鼠肺血管内皮细胞上周细胞覆盖率的变化和检测肺血管周细胞标志物PDGFR-β和NG2表达的变化;观察周细胞靶向脂质体对脓毒症大鼠肺血管铁死亡的影响:检测肺血管铁死亡相关蛋白GPX4和COX表达和肺血管LPO含量的变化。4.Rosi@LNP-aminopeptidase A/NG2对脓毒症大鼠肺血管屏障功能和肺功能的保护作用盲肠结扎穿孔术前经尾静脉注射脂质体(Rosi 0.2mg/kg)。观察周细胞靶向脂质体对脓毒症大鼠肺血管屏障功能的保护作用:检测肺血管对EB和FITC-BSA透过率和肺血管内皮细胞间紧密连接结构的变化。观察周细胞靶向脂质体对脓毒症大鼠肺功能的保护作用:检测肺组织中性粒细胞浸润情况、肺湿干质量比和动脉血气各项指标的变化。5.Rosi@LNP-aminopeptidase A/NG2对脓毒症大鼠重要器官功能和动物存活的保护作用盲肠结扎穿孔术前经尾静脉注射脂质体(Rosi 0.2mg/kg)。观察周细胞靶向脂质体对脓毒症大鼠重要器官功能的保护作用:观察心脏、肝脏和肾脏病理结构和功能的变化;检测各组大鼠肝脏、肾脏、肠道血流量的变化;同时观察并记录各组大鼠72h存活率和存活时间。主要研究结果第一部分脓毒症后周细胞数量减少与血管渗漏的关系脓毒症大鼠肺血管周细胞大量脱落,表现为肺血管周细胞标志物PDGFR-β和NG2表达水平均显著降低,内皮细胞上周细胞覆盖率显著降低;肺血管屏障功能严重破坏,表现为肺血管对EB和FITC-BSA透过率显著增高和肺血管内皮细胞间紧密连接开放程度明显增高。肺功能严重受损表现为:肺病理结构破坏且大量中性粒细胞浸润;肺湿干质量比显著增加,肺水肿严重;动脉血气结果显示氧分压、血氧饱和度、pH显著降低,二氧化碳分压显著升高。结果提示,脓毒症大鼠肺血管周细胞大量脱落,肺血管屏障功能和肺功能严重破坏,脓毒症后周细胞数量的减少与血管渗漏密切相关。第二部分周细胞铁死亡在脓毒症后肺血管渗漏中的作用1.LPS处理周细胞发生严重铁死亡,Fer-1减轻周细胞铁死亡,改善血管内皮细胞屏障功能铁死亡抑制剂Fer-1改善LPS处理周细胞活性,减轻周细胞铁死亡,表现为周细胞内Lipid ROS、LPO、Fe~(2+)含量显著降低,GSH/GSSG比值显著升高,铁死亡相关蛋白GPX4表达显著增加,COX表达显著降低。Fer-1预处理周细胞后将周细胞与血管内皮细胞共培养,Fer-1明显提高LPS处理血管内皮细胞TER和减少FITC-BSA透过率。上述结果提示,在细胞水平LPS处理周细胞存在严重铁死亡,铁死亡抑制剂Fer-1明显减轻LPS处理周细胞铁死亡,改善血管内皮细胞屏障功能。2.脓毒症大鼠肺血管周细胞铁死亡与肺血管渗漏密切相关,Fer-1改善脓毒症大鼠肺血管屏障功能Fer-1减轻脓毒症肺血管周细胞铁死亡,表现为肺血管周细胞内Lipid ROS含量显著降低;Fer-1减轻脓毒症大鼠肺血管铁死亡,表现为肺血管内LPO含量显著降低,肺血管铁死亡相关蛋白GPX4表达增加,COX2表达降低;Fer-1显著减少脓毒症大鼠肺血管周细胞脱落,表现为肺血管内皮细胞上周细胞覆盖率明显增加,肺血管周细胞标志物NG2和PDGFR-β表达均增加。Fer-1显著减轻脓毒症大鼠肺血管渗漏,表现为肺血管对EB和FITC-BSA透过率显著降低和内皮细胞紧密连接开放程度降低。Fer-1显著改善肺功能,表现为肺动脉血气各项指标显著改善,肺组织中性粒细胞浸润减少,肺水肿减轻,肺湿干质量比显著降低。Fer-1显著减轻脓毒症大鼠炎症反应,提高脓毒症大鼠72小时存活率和延长存活时间。上述结果提示,脓毒症大鼠肺血管周细胞Muscle biopsies存在铁死亡且与肺血管渗漏密切相关;Fer-1可显著减轻脓毒症大鼠肺血管周细胞铁死亡,减少周细胞脱落,减轻脓毒症大鼠肺血管渗漏和改善肺功能,进而减轻脓毒症大鼠炎症反应,提高动物存活率和延长存活时间。第三部分脓毒症周细胞铁死亡的机制1.LPS处理周细胞蛋白组学的变化主成分分析和样本相关性热图提示,LPS处理周细胞与正常对照组周细胞两组样本间离散程度大,相似度低,可用于后续分析。对比分析发现203个蛋白显著上调,93个蛋白显著下调;对差异蛋白进行KEGG富集分析后发现:铁死亡通路,脂代谢通路包括甘油磷脂代谢通路、脂肪酸合成通路等显著上调;Hippo通路等显著下调。2.LPS处理周细胞代谢组学的变化主成分分析和样本相关性热图提示,LPS处理周细胞与正常对照组周细胞两组样本间离散程度大,相似度低,可用于后续分析。对比分析发现两组样本间共有111个代谢产物具有显著性差异,其中还原型谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸等显著下调,氧化型谷胱甘肽等显著上调;对差异代谢产物进行KEGG富集分析后发现,脂代谢相关通路被显著富集。3.调控周细胞ACSL4表达改善LPS处理周细胞线粒体功能,减轻周细胞铁死亡蛋白组学联合代谢组学分析发现脓毒症周细胞发生代谢重编程,脂代谢严重紊乱。蛋白组学提示LPS处理周细胞ACSL4显著上调,通过腺病毒RNAi敲低周细胞ACSL4表达水平能明显改善LPS处理周细胞线粒体功能,表现为线粒体内ROS生成减少、线粒体膜电位增高,呼吸功能改善,PGC-1α表达增加。上述结果提示,LPS处理周细胞主要通过提高ACSL4表达从而抑制PGC1-α表达,破坏线粒体功能,促进线粒体内ROS生成,造成严重氧化应激,进而诱导周细胞铁死亡;降低周细胞ACSL4表达通过恢复脓毒症周细胞PGC-1α表达,改善线粒体功能,减轻周细胞铁死亡。4.调控周细胞YPA1表达可降低LPS处理周细胞ACSL4表达,改善周细胞活性LPS处理周细胞内YAP1表达水平显著增加且YAP1蛋白核转位增加。通过腺病毒RNAi降低周细胞YAP1表达水平能显著降低LPS处理周细胞内ACSL4表达水平,改善周细胞细胞活性。上述结果提示,LPS处理周细胞YAP1核转位增加并促进ACSL4表达,进而促进周细胞铁死亡;敲低周细胞YAP1表达可降低周细胞ACSL4表达水平,改善周细胞活性。此网站第四部分靶向调控周细胞ACSL4表达对脓毒症后肺血管周细胞铁死亡及肺血管屏障功能的影响1.调控周细胞ACSL4表达对LPS处理血管内皮细胞屏障功能的保护作用在细胞水平,敲低周细胞ACSL4表达后,将周细胞与血管内皮细胞共培养可明显提高LPS处理血管内皮细胞TER,减少FITC-BSA透过率。2.载罗格列酮(Rosiglitazone,Rosi)及靶向周细胞脂质体(Rosi@LNP-aminopeptidase A/NG2)的制备及理化性质评价本实验选用薄膜分散法方法成功制备了Rosi@LNP-AA/NG2,并选用透射电镜和DLS对脂质体形貌和粒径进行了考察,粒径在100nm左右,形态为球形。免疫荧光结果显示脂质体具有良好的周细胞靶向性。本实验通过HPLC测定了Rosi@LNP-AA/NG2在pH7.4的PBS溶液中的累积释放量。另外通过HPLC标准曲线法,测定Rosi@LNP-AA/NG2的载药量为8.6%,包封率为85%,脂质体具有较好的载药量及包封率,为下一步体内实验提供了可能。3.Rosi@LNP-AA/NG2对脓毒症大鼠肺血管周细胞的保护作用与Rosi@LNP相比,Rosi@LNP-AA/NG2显著减轻脓毒症大鼠肺血管周细胞铁死亡,表现为肺血管周细胞内Lipid ROS含量显著降低;显著减轻脓毒症大鼠肺血管铁死亡,表现为肺血管内LPO含量显著降低,肺血管铁死亡相关蛋白GPX4表达增加,COX2表达降低;显著减少周细胞脱落,表现为肺血管周细胞标志物PDGFR-β和NG2表达均增加和肺血管内皮细胞上周细胞覆盖率显著增加。4.Rosi@LNP-AA/NG2对脓毒症大鼠肺血管屏障功能和肺功能的保护作用与Rosi@LNP相比,Rosi@LNP-AA/NG2显著改善肺血管屏障功能,表现为肺血管对EB和FITC-BSA透过率显著降低,肺血管内皮细胞紧密连接开放程度降低;Rosi@LNP-AA/NG2显著改善肺功能,表现为肺组织中性粒细胞浸润显著降低,肺水肿显著改善,肺湿干质量比显著降低,动脉血气结果显示氧分压、血氧饱和度、pH显著升高,二氧化碳分压显著降低。5.Rosi@LNP-AA/NG2对脓毒症大鼠重要器官功能和存活的保护作用与Rosi@L相比,Rosi@LNP-AA/NG2显著减轻脓毒症大鼠炎症反应;改善脓毒症大鼠心脏、肝脏和肾脏病理结构;改善脓毒症大鼠肝肾功能,减轻心肌损伤;提升脓毒症大鼠肝脏、肾脏和肠道血流量;显著提高脓毒症大鼠72小时存活率和延长存活时间。结论1.脓毒症大鼠肺血管周细胞发生铁死亡,铁死亡是脓毒症肺血VX-661半抑制浓度管周细胞大量脱落的重要原因。铁死亡抑制剂Fer-1能显著减轻脓毒症大鼠肺血管周细胞铁死亡,减少周细胞脱落,改善肺血管屏障功能。2.脓毒症周细胞铁死亡机制与周细胞Hippo通路下调,YAP1核转位增加并促进ACSL4表达密切相关。ACSL4主要通过抑制PGC-1α表达,导致线粒体功能受损,线粒体内ROS大量生成,周细胞内大量Lipid ROS和脂质过氧化物蓄积,导致周细胞发生铁死亡。3.靶向调控周细胞ACSL4表达能显著减轻脓毒症大鼠肺血管周细胞铁死亡,减少肺血管周细胞脱落,改善脓毒症大鼠肺血管屏障功能,发挥对重要器官功能的保护作用。