背景多发性硬化症(Multiple sclerosis,MS)是一种由自身免疫机制触发引起不同程度的轴突和神经元损伤为特征的中枢神经系统(Central nervous sysMEM modified Eagle’s mediumtem,CNS)炎症性脱髓鞘疾病。MS具有确诊周期长、难度大,致残率高的特点。目前的治疗方法大都难以阻止MS患者的临床病程,因此,寻找补充和替代疗法尤为重要。尽管MS病因不清,但主要观点认为是由个体遗传易感性和环境因素共同引发的。营养干预作为一种可以改变环境因素的手段,通过改善肠道菌群而对MS患者产生积极保护作用。柚皮素(Naringenin,Nar)是柑橘/葡萄柚中的主要黄烷酮,存在于多种水果与草药中,具有安全、无毒和无副作用的优点,并能发挥抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用。课题组早期的系列研究发现柚皮素通过抑制炎症、T细胞介导的免疫应答及维持血脑屏障的完整性而发挥其在MS的理想实验动物模型-实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)中的保护作用,但其最佳的保护剂量及其确切的作用机制仍不清楚。因此,本课题将采用网络药理学方法分析柚皮素防治MS的关键靶点和作用通路,进一步研究保护EAE的最佳柚皮素剂量,并明确肠道微生物群及其代谢物在柚皮素缓解EAE过程中可能发挥的作用,为缓解MS和其他自身免疫病提供新的思路。方法1.采用TCMSP、Swiss和CTD数据库筛选柚皮素的相关靶点,Gene Gards、Disge Net和CTD预测T细胞介导的自身免疫性疾病与MS的潜在靶点,取得交集靶点后,利用String数据库构建靶点之间的网络联系,采用DAVID数据库对靶点进行生物学通路的富集分析,借助分子对接软件预测柚皮素与核心靶点结合的稳定性。2.随机选取6-8周的雌性C57BL/6小鼠分为四组(EAE组、0.125%Nar+EAE组、0.5%Nar+EAE组、2%Nar+EAE组),按照上述剂量膳食干预四周后诱导EAE。每天记录体重和神经功能学评分直至处死,HE和LFB染色评价脊髓炎症细胞浸润和脱髓鞘情况。确定保护EAE获悉更多的最佳柚皮素剂量后,随机选取6-8周的雌性C57BL/6小鼠分为两组,相应的膳食干预四周后诱导EAE。在发病高峰期(第14天)收集粪便、脑组织和脊髓样本,利用RNA-seq测序方法分析脊髓基因表达谱的变化情况;利用16S r RNA基因测序方法和液相色谱-质谱联用法评价肠道菌群和肠道菌群代谢物以及脑组织代谢物的变化情况。最后进行粪球移植验证肠道菌群在柚皮素缓解EAE中的作用。结果1.基于网络药理学分析柚皮素、T细胞介导的自身免疫性疾病与MS的结果显示:筛选出柚皮素相关靶点30个,T细胞介导的自身免疫性疾病靶点5569个,MS靶点689个,分析获得AKT1、PTGS2、CASP3、MAPK1、ESR1、CAT六个核心靶点以及HIF-1、Estrogen、TNF、和NF-κB四条关键信号通路;分子对接结果显示,柚皮素与核心靶点PTGS2、CASP3、MAPK1、ESR1、CAT均有较强的结合能力。2.柚皮素对EJQ1作用AE小鼠肠道菌群及其代谢物和脊髓基因表达谱的影响:(1)膳食2%剂量柚皮素具有最佳改善EAE的发生率和临床症状的作用,依据此结果进行后续研究;(2)转录组学分析提示2%Nar+EAE组与EAE组有141个差异基因,其中38个上调基因,103个下调基因。差异基因的GO和KEGG富集结果显示,其主要参与T细胞受体信号通路和Th1、Th2、Th17细胞的分化以及T细胞激活、免疫反应、免疫系统进程调节和炎症反应等生物学过程;(3)膳食柚皮素的正常小鼠肠道微生群的物种和群落丰富度较正常饮食组显著增加;(4)在EAE发病高峰期,EAE组和2%Nar+EAE组之间肠道微生物群差异显著,后者的物种丰度显著增加。2%Nar+EAE组富集的Paraprevotellaceae和Comamonadaceae与神经功能学评分呈显著的负相关性,而EAE组富集的Desulfovibrionaceae,Dehalobacterium,Deltaproteobacteria,RF39,Anaerotruncus与神经功能学评分呈显著的正相关性;(5)在EAE发病高峰期,对两组肠道菌群的差异代谢物分析表明,与EAE组相比,2%Nar+EAE组的脂质代谢增加25%左右,其中黄酮类化合物和异黄酮代谢物明显增加;(6)肠道菌群和脑组织的共同代谢物有5种,分别是棕榈酸、S-腺苷甲硫氨酸、2-氧己酸钠、鸟嘌呤核苷以及牛磺酸;(7)肠道菌群的标志物种与差异代谢物的联合分析表明,包含柚皮素在内的黄酮类化合物与2%Nar+EAE组的标志物种Paraprevotellaceae呈显著的正相关,与EAE组的标志物种Desulfovibrionaceae和Dehalobacterium呈显著的负相关;(8)柚皮素小鼠粪便移植给EAE小鼠可改善其临床症状和发病的严重程度以及组织病理学变化。结论1.柚皮素可能通过核心靶点AKT1、PTGS2、CASP3、MAPK1、ESR1、CAT调控HIF-1、estrogen、TNF、和NF-κB信号通路,发挥防治MS的作用;2.2%柚皮素是防治EAE的最佳保护剂量,在该剂量下,柚皮素通过调控肠道菌群及其代谢物的改变以及与免疫炎症相关的脊髓基因表达发挥对EAE的保护作用。