目的:黑质(Substantia nigra,SN)多巴胺能神经元选择性缺失是帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的主要病理特征,且SN铁沉积是PD发病的关键因素,铁过量可导致细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)过多产生,引起细胞损伤。胆固醇在脑内含量丰富,过高的胆固醇可引起脑内铁代谢改变和细胞死亡,与PD发病密切相关。胆固醇衍生物24S-羟基胆固醇(24S-Hydroxycholesterol,24SOHC)在PD患者的血浆和脑脊液中显著升高,被认为是潜在的治疗靶点,然而胆固醇及24S-OHC对神经元铁代谢影响及细胞损伤的机制目前还不清楚。本实验旨在探讨胆固醇及24S-OHC对神经元中铁代谢、细胞损伤的影响及其机制,以期为PD防治提供新的实验支持。方法:应用Cell counting kit-8(CCK-8)试剂盒检测SH-SY5Y神经元和原代中脑腹侧(Ventral mesencephalon,VM)神经元活力,应用流式细胞术检测细胞内ROS水平,应用铁试剂盒检测细胞内铁含量,应用透射电子显微镜观察细胞器形态,应用免疫印迹法检测细胞内铁死亡、凋亡和坏死性凋亡相关蛋白表达,应用实时定量荧光PCR检测细胞内促炎MAPK抑制剂细胞因子表达。结果:1.胆固醇T‑cell-mediated dermatoses对SH-SY5Y神经元的影响。1.1胆固醇处理SH-SY5Y神经元,与对照组相比,100μM浓度处理时细胞活力升高,因此选择10μM、100μM作为后续实验浓度;100μM处理组细胞内ROS水平升高(P<0.001),铁螯合剂去铁胺(Deferoxamine,DFO)共处理后,ROS水平升高被部分抑制(P<0.05)。1.2胆固醇处理SH-SY5Y神经元,与对照组相比,100μM处理组细胞内铁调节蛋白1(Iron regulatory protein 1,IRP1)表达升高(P<0.001),ROS抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)预处理后,IRP1蛋白表达升高被抑制(P<0.01);转铁蛋白受体1(Transferrin receptor 1,Tf R1)、铁转入蛋白二价金属离子转运蛋白1(Divalent metal transporter 1,DMT1)、铁蛋白(Ferritin)表达升高(P<0.05,P<0.001),铁转出蛋白(Ferroportin 1,FPN1)表达降低(P<0.001);细胞内二价铁和总铁含量升高(P<0.01,P<0.001),而谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)的蛋白表达无明显变LY294002生产商化(P>0.05),细胞未发生铁死亡。1.3胆固醇处理SH-SY5Y神经元,与对照组相比,100μM处理组细胞内胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,Erk)和核因子激活的B细胞的κ-轻链增强(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)的蛋白磷酸化水平升高(P<0.001),DFO共处理后,二者磷酸化水平升高被抑制(P<0.01,P<0.001)。1.4胆固醇处理SH-SY5Y神经元,与对照组相比,100μM处理组内细胞内白介素1-β(Interleukin-1 beta,IL-1β)、白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)mRNA表达上调(P<0.001),加入Erk抑制剂PD98095、DFO、NAC后,二者表达上调均被抑制(P<0.001)。2.24S-OHC对VM神经元的影响。2.1胆固醇处理SH-SY5Y神经元,与对照组相比,50μM,100μM处理组细胞内胆固醇24-羟化酶(Cholesterol 24-hydroxylase,CYP46A1)蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.001)。2.2 24S-OHC处理原代VM神经元,与对照组相比,0.05μM浓度处理时细胞活力降低,因此选择0.01μM,0.1μM作为后续实验浓度;0.01μM,0.1μM处理组细胞内ROS水平明显升高(P<0.05,P<0.01)。2.3 24S-OHC处理原代VM神经元,与对照组相比,0.1μM处理组细胞内IRP1、Tf R1、DMT1、Ferritin蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01),FPN1蛋白表达降低(P<0.01),铁调素Hepcidin mRNA表达在0.01μM处理组细胞内上调(P<0.001);细胞内二价铁和总铁浓度升高(P<0.01),GPX4和铁死亡抑制蛋白1(Ferroptosis suppressor protein 1,FSP1)的蛋白表达无明显变化(P>0.05),细胞未发生铁死亡。2.4 24S-OHC处理原代VM神经元,与对照组相比,0.1μM处理组细胞内Cleaved caspase-3蛋白表达升高(P<0.01),B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)/BCL2-associated X的蛋白质(BCL2-associated X,BAX)蛋白表达比值降低(P<0.05),细胞发生凋亡;受体相互作用蛋白激酶1(Receptor-interacting protein kinase1,RIPK1)、RIPK3、磷酸化混合谱系激酶结构域样蛋白(Phosphorylated mixed lineage kinase domain-like,p-MLKL)蛋白表达升高(P<0.01、P<0.001),加入坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)预处理后,三种蛋白表达均被抑制(P<0.001),细胞发生坏死性凋亡;DFO共处理后,Cleaved caspase-3蛋白表达升高被抑制(P<0.05),而p-MLKL蛋白表达不被影响(P<0.001);电镜下观察到0.1μM24S-OHC处理组细胞内线粒体出现了不同程度的核膜破裂,染色质凝集现象,也有细胞发生细胞质空泡化,细胞器肿胀,膜破裂,内容物流出的现象,进一步证明细胞发生了凋亡和坏死性凋亡。3.24S-OHC对SH-SY5Y神经元的影响。3.1 24S-OHC处理SH-SY5Y神经元后,与对照组相比,5μM浓度处理时细胞活力降低,因此选择2μM、5μM作为后续实验浓度;5μM 24S-OHC处理组细胞内IRP1、DMT1蛋白表达升高(P<0.01),Tf R1、FPN1蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),GPX4蛋白表达不变(P>0.05),细胞未发生铁死亡。3.2 24S-OHC处理SH-SY5Y神经元后,与对照组相比,5μM处理组细胞内Cleaved caspase-3表达量升高(P<0.001),Bcl-2/Bax蛋白表达比值降低(P<0.001),细胞发生了凋亡;Nec-1预处理后,细胞活力下降程度减轻(P<0.001),细胞发生了坏死性凋亡。3.3 24S-OHC处理SH-SY5Y神经元后,与对照组相比,5μM处理组内细胞内IL-1β、IL-6 mRNA表达上调(P<0.01,P<0.001)。结论:1.胆固醇使SHSY-5Y细胞ROS水平升高,通过IRP1的激活增加铁的转入减少铁的转出使细胞内铁含量升高,但细胞不发生铁死亡;胆固醇使细胞内促炎因子IL-1β和IL-6表达量升高,可能与Erk-NF-κB通路有关,此过程可被DFO部分抑制。2.24S-OHC使原代培养的VM神经元和SHSY-5Y细胞ROS水平升高,通过IRP1激活增加铁的转入减少铁的转出使细胞内铁含量升高;24S-OHC不引起细胞铁死亡但可诱导细胞凋亡和细胞坏死性凋亡,铁离子螯合剂DFO能部分抑制细胞凋亡,但不能抑制细胞坏死性凋亡。本实验通过不同浓度的胆固醇和24S-OHC作用于SH-SY5Y神经元、原代培养的VM神经元,观察了胆固醇对细胞铁代谢和细胞损伤的影响及其相关机制,为神经退行性疾病的预防和治疗提供了新的实验支持。