油菜根肿病是由原生动物芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)侵染引起的重要土传病害,主要为害十字花科的蔬菜和作物。由于根肿菌是活体营养专性寄生的病原物,没有建立稳定的遗传转化体系,致病机制尚不清楚,因此,全面了解根肿菌的生物学特性,特别是其致病机制对研发新的防控技术具有重要意义。实验室前期对根肿菌单孢分离菌株ZJ-1的基因组进行de novo测序,结合基因组学、转录组学和分泌蛋白组学的方法鉴定出两个肽酶抑制剂PbPI16-1和PbPI16点击此处-2,本研究对这两个蛋白的生物学功能进行了初步探索,取得的阶段性进展如下:1.PbPI16-1的生物学功能的初步探索:全长的PbPI1Alpelisib溶解度6-1基因由1206个核苷酸组成,蛋白由402个氨基酸残基组成,分子量约为44 kD,含有一个信号肽和一个肽酶抑制剂结构域。PbPI16-1蛋白具有类似效应子的功能,能够抑制由促凋亡蛋白Bax引起的烟草细胞坏死。亚细胞定位发现PbPI16-1定位于细胞膜、细胞质、细胞核以及质外体空间,去信号肽后,失去分泌功能并且在细胞质中聚集成团。利用qPCR技术对其侵染阶段的表达特征分析表明PbPI16-1在根肿菌各个侵染阶段都有表达,其中在皮层侵染阶段表达量最高。通过蘸花法获得3株超表达PbPI16-1的转基因植株,其中L18、L19和L21对根肿菌的生防效果分别为38.45%、32.10%和24.55%,表明超表达PbPI16-1的转基因植株提高了防御根肿菌的能力。对PbPI16-1转基因株系进行用flg22处理,qPCR检测结果表明SA信号途径的抗性基因表达水平显著增高。这些结果表明PbPI16-1可能在根肿菌侵染过程中发Median survival time挥作用。2.PbPI16-2的生物学功能的初步探索:全长的PbPI16-2基因由1038个核苷酸组成,蛋白由345个氨基酸残基组成,分子量约为38 kD,含有一个信号肽和一个肽酶抑制剂结构域。PbPI16-2能够抑制由促凋亡蛋白Bax引起的烟草细胞坏死。亚细胞定位于细胞膜、细胞质、细胞核以及质外体空间,去除信号后失去分泌功能及在细胞质中聚集成团。PbPI16-2基因在根肿菌各个侵染阶段都有表达,其中在皮层侵染阶段表达量最高。通过蘸花法获得2株超表达PbPI16-2的转基因植株,其中L26和L27对根肿菌的生防效果分别为39.02%和32.35%,超表达PbPI16-2可以提高植物抗根肿的能力。用flg22诱导转基因植株抗性基因的表达,qPCR检测结果表明SA信号途径相关的抗性基因显著上调表达;同时Western blot检测结果表明转基因植株的MAPK磷酸化激活水平比野生型拟南芥Col-0高。通过IP-MS技术筛选出322个与PbPI16-2互作的候选蛋白,筛选出33个蛋白和PbPI16-2共转化酵母细胞,利用酵母双杂交技术验证了33个候选蛋白与PbPI16-2的互作,结果仅有GLL23和JAL23能与PbPI16-2在酵母体内互作。荧光素酶互补实验结果表明GLL23和JAL23能与PbPI16-2在烟草细胞内互作。