选题依据:非淀粉多糖(NSP)是植物中除淀粉之外的所有多糖类碳水化合物的总称,该物质难以被猪等单胃动物消化吸收。随着酒糟、麸皮等新型替代性饲料的开发,饲料中NSP含量显著增加,严重影响了饲料营养物质的消化吸收,甚至可能引起消化器官的功能损伤或病变,导致代谢紊乱。目前国内外倾向于采用酶制剂手段来解决该问题,将酶制剂添加到饲料中,降解部分大分子物质,从而提高猪的消化率,缓解消化问题。但NSP酶制剂的使用并未获得统一的标准,不同的饲料原料需合理地制定不同的酶制剂才获悉更多能达到更好的应用效果。课题组在开发新型替代性饲料过程中,发现发芽饲料可以有效分泌蛋白酶、淀粉Bafilomycin A1采购酶等物质,促进猪消化吸收率,但对NSP的降解能力微乎其微,且目前针对该方面的研究也相对较少,因此以发芽饲料为底物,通过筛选产NSP酶菌株,科学地制备NSP复合酶,为发芽饲料提供一个效果明显的NSP复合酶制剂是非常必要的。目的:1.筛选高效生产NSP酶的菌株;2.科学地制备适用于发芽饲料的NSP复合酶制剂。方法:1.通过单胃动物仿生消化系统处理发芽饲料,收集残渣并以此为底物在适宜的环境中培养微生物菌群,将微生物菌群分离纯化后选择性培养,筛选出降解非淀粉多糖效果较好的菌株,通过显微镜观察和分子鉴定对其进行菌株鉴定。2.对筛选好的菌株进行产酶培养条件优化,包括:碳源、氮源、p H、培养温度、接种量以及培养时间。优化后采用硫酸铵分级盐析法纯化收集酶液。3.通过单因素试验和响应面设计确定复合酶中各非淀粉多糖酶的最佳添加量、最佳酶解温度和最佳酶解时间;将获得的酶制剂与市售酶制剂添加到饲料中通过测定饲料体外干物质消化率变化和能量变化,以确定该酶制剂的有效性。结果:1.对微生物菌群选择性培养,确定产纤维素酶、产果胶酶能力强的菌株为青霉属菌株ZT-7;产β-葡聚糖酶能力强的菌株为曲霉属菌株ZT-5;产木聚糖酶能力强的菌株为青霉属菌株ZT-10;产甘露聚糖酶能力强的菌株为曲霉属菌株ZT-12。2.对菌株产酶培养条件进行优化,确定产纤维素酶菌株ZT-7的最佳培养条件为:麸皮3.0%、蛋白胨3.0%、p H 8.0、温度29.0℃、接种量3.0%、培养时间5.3 d,该条件下酶活性最高为76.42 U/m Calbiochem Probe IVL;产果胶酶菌株ZT-7的最佳培养条件为:混合饲料3.5%、酵母浸粉3.0%、p H 8.0、温度29.6℃、接种量2.0%、培养时间3.0 d,该条件下酶活性最高为174.53 U/m L;产β-葡聚糖菌株ZT-5的最佳培养条件为:麸皮5.0%、蛋白胨3.0%、p H 8.0、温度29.9℃、接种量4.0%、培养时间4.0 d,该条件下酶活性最高为126.54 U/m L;产木聚糖酶菌株ZT-10的最佳培养条件为:木聚糖3.1%、硫酸铵4.0%、p H 7.0、温度27.8℃、接种量2.3%、培养时间3.0 d,该条件下酶活性最高为584.12 U/m L;产甘露聚糖酶菌株ZT-12的最佳培养条件为:魔芋甘露聚糖3.0%、蛋白胨3.2%、p H 8.0、培养温度30.0℃、接种量2.8%、培养时间为2.2 d,该条件下酶活性最高为490.05 U/m L。3.通过单因素和响应面设计确定最佳复合酶为:纤维素酶5424 U/kg、果胶酶4291 U/kg、β-葡聚糖酶2830 U/kg、木聚糖酶1444 U/kg、甘露聚糖酶1374 U/kg。通过酶学性质研究得知该复合酶最佳酶解温度为55℃,最佳酶解时间为10 h。对该酶进行体外模拟消化验证发现其体外干物质消化率(IVDMD)高于市售商品酶值,且残渣发热量低于市售NSP酶,说明该酶具有较好的应用效果。结论:本实验筛选到4种高效非淀粉多糖酶菌株,通过培养条件优化和酶谱筛选,制备出一种NSP复合酶制剂,通过体外模拟消化验证,确定该酶制剂具有较高的使用价值,为发芽饲料的应用提供了技术。