目的和意义:肉鸡是一种常见的食用性动物,生长周期短而广受人们欢迎。目前集约化养殖使家禽行业过度关注肉鸡的生长速度,肉鸡的快速生长使其骨骼发育不足以支撑体重的增长,从而引发腿病。胫骨软骨发育不良(TD)是肉鸡常见的腿部疾病之一,临床症状表现为行动迟缓、双翅或单翅支撑行走。据统计,在世界范围内TD占肉鸡骨骼疾病发病率的30%。此外,TD引起的肉鸡骨骼发育问题在美国导致了高达1.5亿美元的经济损失。因此TD的防治应该在家禽业得到重视。引起TD的病因有很多,高血糖水平、肠道菌群稳态和血管分布在很大程度上影响着肉鸡TD的发生。但TD的具体发病机制尚不明确。骨碎补总黄酮(TFRD)是水龙骨科植物槲蕨根茎中的提取物,具有促进骨骼生长发育的作用。先前的研究也发现TFRD有改善肉鸡TD的作用,但其具体保护机制尚不明确。本试验选取240只1日龄Belumosudil抑制剂AA(艾拔)肉鸡,分为对照组(CON)、福美双组(TD)和骨碎补总黄酮治疗组(TFRD)。肉鸡适应3天,然后饲喂50 mg/kg的福美双4天以建立TD模型,拌料添加500 mg/kg骨碎补总黄酮进行治疗至21天结束。探讨TD肉鸡具体的发病机制以及TFRD对TD肉鸡的具体保护作用。主要研究内容与结果如下:研究一:TD肉鸡胫骨发育的变化及TFRD的治疗效果肉鸡饲喂福美双4天后出现明显的TD临床症状,双腿劈叉或单翅支撑行走,表明TD模型建立成功。一般生长性能的结果提示TFRD治疗能显著增加TD肉鸡的体重和胫骨重(p<0.001),并显著降低生长板宽度(p<0.001)。病理组织学结果显示TFRD治疗显著改善TD肉鸡胫骨钙化延迟的现象。以上结果说明TFRD对TD肉鸡胫骨发育具有改善作用。研究二:TD肉鸡糖代谢的变化及TFRD的治疗效果为了研究血糖的变化是否与TD有关,首先通过试剂盒检测肉鸡血糖水平,结果显示,与CON组相比,TD肉鸡血糖的水平显著升高(p<0.001);TFRD治疗后,TD肉鸡的血糖降低至正常水平。实时荧光定量PCR(q RT-PCR)结果显示TFRD治疗显著降低了TD肉鸡升高的GLUT 8和GLUT 12 m RNA水平(p<0.001)。其次对胰腺进行病理组织学评估,结果表明TD肉鸡胰腺中有大量炎症浸润;TFRD组肉鸡胰腺发育正常,无炎症浸润。最后对胰腺功能的检测结果显示,与CON组相比,TD肉鸡胰岛素、脂肪酶和淀粉酶的水平明显降低(flamed corn strawp<0.Laduviglusib说明书01);与TD组相比,TFRD组肉鸡脂肪酶和淀粉酶的水平明显升高(p<0.001)。以上结果说明TFRD改善TD肉鸡胰腺功能并且抑制血糖升高。研究三:肠道菌群对肉鸡血糖水平的影响通过粪菌移植试验(FMT)探究肠道菌群与血糖之间的关系。选取60只健康的1日龄AA(艾拔)肉鸡,分为CON组和TD组。肉鸡适应3天,饲喂50 mg/kg的福美双4天建立TD模型。粪菌移植从第7天开始,持续一周。从CON肉鸡(供体)中提取粪便,通过灌胃移植到TD肉鸡中(受体,15只/FMT-Con组);从TD肉鸡(供体)中提取粪便,通过灌胃移植到CON肉鸡中(受体,15只/FMT-TD组)。结果发现FMT试验恢复TD肉鸡肠道菌群的紊乱。与TD组相比,FMT-Con组肉鸡的血浆GLU水平、GLUT8和GLUT2的m RNA表达显著降低(p<0.001)。这说明TD肉鸡肠道菌群紊乱的恢复伴随着血糖水平的降低。研究四:基于肠-胰轴探究TFRD对TD肉鸡糖代谢的影响为了探究肠道菌群影响血糖水平的具体机制,先对肠道进行屏障检测,结果显示TFRD治疗显著增加TD组肉鸡的肠道绒毛高度和肠壁厚度(p<0.001),显著提高紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的表达(p<0.001)。这说明TFRD改善TD肉鸡肠道屏障功能。然后肠道菌群的分析结果显示,与CON组相比,TD组Blautia和Coprococcus的丰度显著升高。TFRD治疗降低TD组Blautia的丰度。Blautia和Coprococcus是富集代谢丁酸的菌属。因此对短链脂肪酸进行分析,结果表明TFRD治疗降低了TD组丁酸的含量。最后对丁酸受体GPR109A进行检测,结果表明TFRD治疗降低TD肉鸡胰腺中GPR109A的水平(p<0.001)。以上这些结果说明肠道菌群Blautia代谢的丁酸作用于胰腺上的GPR109A受体调节血糖水平。研究五:基于PI3K/AKT/VEGFA信号通路探究TFRD对TD高糖肉鸡骨代谢的影响为了探究TD肉鸡胫骨损伤的调控机制,对胫骨进行转录组测序。将差异表达的胫骨基因映射到KEGG数据库中进行功能聚类分析,结果显示局灶性黏附通路表达最为明显,局部粘附激酶在血管形态发生和修复中起着至关重要的作用,并通过激活PI3K/AKT参与血管内皮细胞的运动、增殖、粘附和凋亡。然后通过组织病理学对肉鸡胫骨生长板血管分布进行检测,结果显示CON组胫骨生长板血管的密度、数量和分布较多;TD组胫骨相应区域未见血管浸润;TFRD组血管的分布、数量和密度明显比TD组丰富。最后通过蛋白免疫印迹(WB)和q RT-PCR技术对PI3K/AKT/VEGFA信号通路进行分析,结果显示,与CON组相比,TD组PI3K和AKT的表达极显著降低(p<0.001),VEGFA的表达升高;与TD组相比,TFRD组PI3K、AKT和VEGFA的表达显著升高(p<0.001)。以上这些结果说明TFRD促进TD肉鸡胫骨生长板血管分布并改善PI3K/AKT/VEGFA信号通路的表达。综上所述,肉鸡肠道菌群中Blautia的代谢产物丁酸通过作用于胰腺中的GPR109A受体来调节葡萄糖稳态。葡萄糖代谢紊乱抑制了胫骨生长板中PI3K/AKT/VEGFA信号通路的表达,从而加剧TD病变。TFRD不仅直接促进骨骼强健,还能通过上述途径调节肠道菌群、降低血糖、促进血管新生,从而抑制肉鸡TD的病变。我们的研究结果提示,肠-胰轴介导的葡萄糖代谢可能是解决骨代谢相关疾病的新靶点,并且TFRD作为一种安全无害的中草药提取物,在家禽代谢性疾病中具有潜在治疗意义。