铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生草本植物,在中国有悠久的栽培历史,因其美丽的花朵和拥有极高的保健价值而受到广泛重视,是一种重要的观赏植物和药用植物。红色器官的铁皮石斛完美地融合了人们对观赏园艺和药用植物的需求,在其进入市场后,倍受欢迎且价格更高。研究表明铁皮石斛红色器官的形成与花青素的合bone biomechanics成有关,而R2R3-MYB转录因子对花青素生物合成途径具有重要的调控作用。本试验研究了两个铁皮石斛中的R2R3-MYB转录因子Do MYB5和Do MYB92,验证了它们的功能并探究了其在花青素生物合成途径中的部分调控机制,主要结果如下:1.利用RT-PCR技术从铁皮石斛中克隆了两个R2R3-MYB基因。通过生物信息学分析发现Do MYB5和Do MYB92都具有两个保守的SANT保守结构域,Do MYB5与杂交石斛的Dh MYB2亲缘关系较近,Do MYB92与课题组前期研究的Do MYB105和拟南芥的At MYB4亲缘关系较近。通过荧光定量试验发现Do MYB5基因在铁皮石斛红色品种的各器官中的表达量比绿色品种高,而Do MYB92基因在铁皮石斛红色器官中的表达量较绿色品种低。2.分别构建了p TRV2e-Do MYB5和p TRV2e-Dob HLH24表达载体,转化农杆菌后注射铁皮石斛的嫩绿叶片,发现注射区域出现红色,同时测定了注射部位的花青素含量,结果发现花青素含量显著高于对照。另外发现,同时注射Do MYB5和Dob HLH24后,混合注射叶片的花青素含量显著高于单一注射。3.采用叶盘法进行烟草的遗传转化,得到转Do MYB5和Do MYB92基因的烟草植株。另外,也将课题组前期得到的Do MYB105和Dob HLH24基因转入烟草,得到转基因植株。对转基因植株的表型观察,发现与野生型烟草相比,OE-Do MYB5株系花器官颜色变化明显,花冠、花萼、花药、花丝及子房的颜色都加深,OE-Dob HLH24株系只有花冠颜色加深,而OE-Do MYB92和OE-Do MYB105株系的花冠颜色比非转基因烟草的花冠浅。对转基因烟草的花冠进行荧光定量PCR分析,结果发现Do MYB5和Dob HLH24可促进转基因烟草花青素生物合成途径中结构基因的表达,其中Do MYB5促进Nt CHS和Nt DFR的表达水平提高最显著,Dob HLH24促进Nt UFGT的表达最明显。Do MYB92和Do MYB105都可抑制Nt CHS、Nt DFR、Nt ANS和Nt UFGT的表达。对转基因烟草的次生代谢产物含量进行测定,结果显示OE-Do MYB5植株和OE-Dob HLH24植株的花青素、原花青素及植物总酚含量均有显著性提高;而OE-Do MYB92和OE-Do MYB105植株的花青素、原花青素及植物总酚含量显著降低。综上,Do MYCX-5461配制B5和Dob HLH24正向调控烟草的花青素生物合成,而Do MYB92和Do MYB105负向调控了烟草的花青素生物合成。4.通过酵母双杂交试验和双荧光素酶互补(Luc)试验发现,转录因子Do MYB5和Do MYB92均能与转录因子Dob HLH24发生互作,形成异源二聚体。双荧光素酶报告基因检测系统分析结果表明Do MYB5和Dob HLH24单独注射能够激活铁皮石斛Do CHS和Do DFR启动子的活性,而Do MYB5和Dob HLH24共同注射后,对Do CHS和Do DFR启动子的激活效果更加显著。Do MYB92则降低了Do CHS和Do DFR启动子的活性。酵母单杂交试验结果显示Do MYB5和Do MYB92可以分别与Do CHS和Do DFR的启动子发生互作。综上,Do MYB5通过调控结构基因Do CHS和Do DFR的启动子从而正向调控铁皮石斛的花青素生物合成;Do MYB92通过调控结构基因Do CHS和Do DFR的启动子从而负向调控铁皮石斛的花青素生物合成途selleckchem Ferrostatin-1径。