选题依据:酸枣仁汤首载于东汉末年张仲景所著的《伤寒杂病论》,由酸枣仁、知母、茯苓、川芎和甘草五味中药组成,具有养血安神、清热除烦之功效。其拟方初衷是为了缓解百姓颠沛流离,精神焦虑不安引起的睡眠障碍。新近的临床研究表明,酸枣仁汤对于广泛性焦虑和抑郁症等疾病的治疗也具有良好的疗效。目前,酸枣仁汤已被开发为锭剂、颗粒剂、浓缩散剂和合剂等不同的制剂类型,用于虚烦不眠、心悸盗汗、头晕眩晕等的治疗。焦虑症是指与实际情况不相符并干扰日常Nirmatrelvir研究购买功能的过度、不切实际的担心和焦虑。临床上焦虑症患者常因持续紧张、恐惧不安等焦虑情绪而引起睡眠障碍。流行病学调查显示,焦虑患者中40%首发表现为失眠,72%的人在患焦虑障碍后或患焦虑障碍的同时伴有失眠。因此,寻找安全有效的替代药物成为亟待解决的问题。中药复方化学成分复杂,其疗效的发挥有赖于进入机体,且作用于相应的靶点而发挥整体药效。即通常认为中药药效成分必须吸收进入血液、到达靶器官并作用于相应靶点后方能发挥抗焦虑的整体药效作用。本研究以酸枣仁汤为研究载体,以药效学为指导,从“体内、外关联分析-体内、网络关联分析-网络、分子对接关联分析”角度,探索了酸枣仁汤防治焦虑症的药效成分及作用机制研究的全新模式。以期通过体外、体内两个层次进行研究,准确、有效地辨识酸枣仁汤中的药效成分,并探究其改善慢性束缚应激(Chronic restraint stress,CRS)模型小鼠焦虑样行为的作用机制。目的:明确酸枣仁汤改善慢性束缚应激模型小鼠焦虑样行为的药效成分,并探讨其作用机制。研究内容及方法:1.酸枣仁汤的化学物质基础研究。建立基于UPLC-Q-TOF-MS/MS的酸枣仁汤化学成分表征分析方法;建立酸枣仁汤HPLC-DAD-ELSD指纹图谱与多成分含量测定相结合的质量评价方法;收集不同产地、不同来源的酸枣仁汤原料药材制备10批酸枣仁汤,收集来自中国大陆、中国香港、中国台湾和日本不同剂型酸枣仁汤,采用已建立的方法对10批自制酸枣仁汤及10批不同剂型市售产品进行指纹图谱相似度评价及13种成分的含量测定。2.酸枣仁汤改善焦虑症的药效学研究。针对焦虑症的关键病理环节,采用CRS诱导焦虑模型,从整体动物水平评价酸枣仁汤防治焦虑的有效性。以地西泮作为阳性对照,采用高架十字迷宫实验、戊巴比妥诱导的睡眠实验、旷场实验、水平横丝等,测定海马组织中五羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)及血清皮质酮(Corticosterone,CORT)和促肾上腺皮质激素释放素(Corticotropin releasing hormone,CRH)中生化指标,评价酸枣仁汤(7、14 g/kg)对CRS模型小鼠的药效学。3.酸枣仁汤潜在药效成分的发现。利用方证代谢组学策略,建立基于UPLC-Q-TOF-MS/MS的血清代谢组学研究方法,采用多元统计分析筛选空白组与模型组差异代谢物,并采用无监督的主成分分析和相对距离法进行代谢轮廓分析及KEGG通路分析;同时进行血清化学分析,鉴别血清移行成分;采用SpearmaProtein Gel Electrophoresisn相关分析对血清移行成分与生物标志物进行相关性分析,以相关系数绝对值大于0.55为指标,辨识出潜在药效成分。4.药效成分的筛选与确证。利用SWISS target prediction、TCMIP、TCMSP和Genecards等数据库分别对酸枣仁汤成分、焦虑及失眠靶点进行预测;采用STRING数据库对交集靶点的蛋白间相互作用强度进行计算;以DAVID数据库对筛选得到的关键靶点进行KEGG通路富集;聚焦关键通路后建立“复方-成分-靶点-通路”网络。采用分子对接技术验证潜在药效成分与关键靶点的相互作用,确证药效成分及酸枣仁汤改善焦虑症的潜在途径。研究结果:1.采用已建立的UPLC-Q-TOF-MS/MS方法,共鉴定了酸枣仁汤中110个化学成分,其中主要以黄酮类、皂苷类及生物碱类化合物为主,其次为苯酞类、苯酚类及苯丙素类化合物,对化合物进行生药学归属,其中35个成分归属于酸枣仁,19个归属于知母,3个归属于茯苓,23个归属于川芎,32个归属于甘草。采用水煎煮法,自制10批酸枣仁汤,出膏率均值为21.57%,在同一色谱条件下,在282 nm标定了5个共有峰,335 nm标定了4个共有峰,相似度分别为0.907～0.999、0.926～0.999;HPLC-ELSD指纹图谱中标定了4个共有峰,相似度为0.946～0.999,不同批次批间差异较小。含量测定结果表明,13种成分在各自的线性范围内拟合系数大于0.9959,线性关系良好,平均加样回收率为93.69%,RSD值平均为2.04%。PLX-4720供应商10批不同剂型市售产品中新芒果苷、乌药碱、芒果苷、异芒果苷、甘草苷、斯皮诺素、阿魏酸、6′′′-阿魏酰斯皮诺素、异甘草苷、知母皂苷BII、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和甘草酸的质量分数分别为0.30～3.38、0.02～0.20、0.27～6.04、0.33～1.38、1.54～12.02、0.16～0.87、0.16～1.27、0.04～0.35、0.25～3.12、3.66～20.92、0.36～0.98、0.32～0.89、4.90～36.37 mg/g,波动范围大。结果表明,不同生产厂家,不同剂型对酸枣仁汤中13种成分的含量影响较大。该方法的建立,不仅为酸枣仁汤类产品的质量评价提供了新的分析方法,也为进一步的药效学和药动学样品的稳定性提供了保证。2.成功复制CRS诱导的焦虑小鼠模型。酸枣仁汤(7 g/kg)能够增加进入高架十字迷宫实验(EPM)中进入开臂的百分比和进入开臂的时间占比;显著增加旷场实验(OFT)中直立次数和移动距离;显著延长戊巴比妥诱导的焦虑小鼠睡眠时间,并缩短睡眠潜伏期。酸枣仁汤显著升高CRS模型下小鼠海马组织5-HT、GABA和NE水平,降低血清CORT和CRH水平。此外,酸枣仁汤以上2个剂量均未产生肌肉松弛作用。3.建立了基于UPLC-Q-TOF-MS技术的血清移行成分及血清代谢组学分析方法;鉴定了CRS模型下小鼠血清中28种内源性差异代谢物,共涉及花生四烯酸代谢、色氨酸代谢等7条主要的代谢通路。酸枣仁汤高剂量能够回调21种代谢产物,涉及花生四烯酸、色氨酸和鞘脂代谢3条代谢通路;酸枣仁汤低剂量回调21种代谢产物,涉及花生四烯酸、色氨酸、鞘脂和亚油酸代谢。在此条件下,小鼠血清中鉴定出的20个原型成分。相关性分析对28个差异代谢物与20个血清移行成分进行分析,辨识了14个成分作为潜在的药效成分。4.网络药理学结果表明,435个与酸枣仁汤成分相关的潜在靶点和397个与焦虑及失眠的相关的潜在靶点,得到67个共有靶点。选择了蛋白作用强度较强(degree值大于平均值)的32个靶点进行通路富集,优选了TNF信号通路、色氨酸生物合成等前51条关键通路。构建了复方-血清成分-靶点-通路关系网络,包括11个成分,32个靶点,51条通路。分子对接结果显示,8个成分与4个蛋白(TNF、HTR_(1A)、MAO_B、SLC6A4)结合力均小于-6 mmol/kcal,酸枣仁皂苷元与知母皂苷元与四个蛋白的结合力(除TNF与知母皂苷元)也均小于-6 mmol/kcal。结论:本研究全面表征了酸枣仁汤的化学成分,建立了准确可靠的酸枣仁汤HPLC-DAD-ELSD的指纹图谱与多成分含量测定的质量评价方法,为市售酸枣仁汤产品的质量控制提供了参考。探索了方证代谢组学与网络药理学相结合筛选和确证酸枣仁汤药效成分及作用机制的研究模式。研究结果为酸枣仁汤的质量标志物(Q-marker)的确定提供了坚实的基础。