增塑剂邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)被用于制造聚乙烯聚合物。流行病学和毒理学的一些研究表明,长期接触DEHP可能对身体有害,包括肾脏毒性,并在潜在疾病的情况下加重肾脏损害。全世界糖尿病人群急剧增加,糖尿病肾病(DN)作为最严重的并发症之一,DEHP的暴露可能会加重肾损伤。然而,在DN的疾病基础下,关于DEHP的毒性研究却很少报道。在本研究中,我Dermal punch biopsy们观察DEHP对高脂肪饮食(HFD)联合链脲霉素(STZ)诱导的糖尿病肾病的毒性作用,并深入探讨可能的毒性机制。结果表明,DEHP暴露明显促进了小鼠的肾脏炎症和氧化应激损伤,P-p38和P-p65蛋白水平增加,并加剧了足细胞特征蛋白podocin的丢失。同时,DEHP暴露还增加了氧化应激水平和炎症因子的分泌。在体外用高葡萄糖(30 mmol/L)刺激足细胞并暴露于不同浓度梯度的DEHP后,也有同样的发现。我们的结果表明,DEHP可能通过介导氧化应激和激活p38MAPK/NF-κB加重DN。目的:使用HFD联合STZ诱导小鼠糖尿病肾病模型,探究DEHP对糖尿病肾病小鼠病理过程的影响。在体外实验中利用小鼠足细胞探讨信号通路p38MAPK/NF-κB在糖尿病肾病中的作用。方法:在体内实验中,每日给予小鼠HFD,喂养四周,在第五周腹腔注射STZ诱导糖尿病肾病模型。模型组每日给予DEHP不同剂量(0.1,10,1000 mg/kg)灌胃,同时对照组给予1000 mg/kg DEHP灌胃。继续喂养五周。五周后,收集24小时尿液,并依照动物伦理处死小鼠。肾组织HE染色和PAS染色观测在糖尿病肾病基础下,DEHP对小鼠肾脏的病理损伤情况;ELISA法测量肾组织中肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素6(IL-6)水平以及丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和还原性谷胱甘肽(GSH)的含量;专业试剂盒检测小鼠血清中肌酐和尿素氮(BUN)含量以及24 h尿液中肌酐和尿蛋白的含量;激光共聚焦法检测小鼠肾组织podocin蛋白表达情况;免疫组化检测小鼠肾组织中NF-κB表达情况;Western blot法检测P-p38、P-p65、podocin蛋白的表达。体外实验中,也分为六组:正常组、高糖组(30 mmol/L)、高糖+DEHP(12.5、50和200μmol/L)、DEHP 200μmol/L对照组。培养24 h后,CCK-8和Transwell法检测DEHP对足细胞增殖迁移能力的影响;DCFH-DA探针标记足细胞ROS,流式细胞仪检测DEHP暴露对ROS的影响;免疫荧光和q RT-PCR检测足细胞中podocin蛋白表达;Western blot法检测足细胞中P-p38、P-p65、podocin蛋白的表达。结果:1.DEHP对小鼠肾指数和功能指标的影响DEHP暴露后DN小鼠肾指数显著增加;ELISA试剂盒检测小鼠血清和24 h尿液,从结果中发现中高剂量的DEHP(10、1000 mg/kg)暴露会明显增加血清中肌酐和尿素氮的水平以及尿液中肌酐和尿白蛋白的水平。提示DEHP的暴露会加重DN的肾脏损伤。2.DEHP对HFD/STZ诱导的DN小鼠的组织病理损伤的影响。HE染色和PAS染色结果显示,正常组肾小管结构正常,排列整齐,肾小球结构完整。与正常组相比,模型组小鼠肾组织出现系膜细胞增生、系膜基质增殖和肾小球基底膜增厚。与模型组相比,DEHP暴露后肾损伤进一步加重。在10mg/kg DEHP模型组中发生炎症细胞浸润,在1000 mg/kg DEHP模型组炎症细胞浸润进一步增加并在肾小球周围出现纤维化。提示DEHP会加速DN小鼠的肾组织损伤进程。3.DEHP对DN小鼠肾组织中氧化应激指标以及TNF-α和IL-6水平的影响与正常组相比,模型组的MDA含量明显提高,SOD和GSH水平明显降低。DEHP暴露后,相对于模型组,中高剂量DEHP(10,1000 mg/kg)能显著提高MDA含量,降低SOD和GSH水平。在肾组织中细胞炎症因子检测结果中发现,模型组小鼠肾脏组织中IL-6和TNF-α的水平比正常组的明显增加。DEHP暴露后,相对于模型组,中高剂量DEHP(10,1000 mg/kg)能显著升高IL-6和TNF-α的水平。值得注意的是,低剂量DEHP(0.1 mg/kg)组的水平也有一定程度的增加。提示DEHP暴露可能通过加重氧化应激,导致氧化与抗氧化系统的失衡,并促进促炎症因子的释放,从而加重DN。4.DEHP对DN小鼠肾组织中P-p38、NF-κB和podocin蛋白表达影响根据免疫组化的结果发现,DEHP暴露显著增加NF-κB蛋白在肾组织中的表达;从免疫荧光结果分析,DEHP暴露能显著降低podocin蛋白表达,高剂量最为显著。根据蛋白免疫印迹法(WB)结果发现,相比于正常组,DN小鼠肾脏中Pp38和P-p65的水平明显增加,而podocin的水平则明显下降。DEHP暴露后,与模型组相比,中高剂量DEHP(10和1000 mg/kg)组的P-p38和P-p65蛋白表达水平明显增加,podocin蛋白表达的水平明显下降。同时,0.1 mg/kg DEHP组的podocin蛋白表达水平也有所下降。提示DEHP可能激活p38MAPK/NF-κB通路加剧podocin蛋白丢失,加重DN。5.DEHP对足细胞增殖迁移活力和ROS水平的影响相比于更多正常组,暴露于高糖后的细胞增殖活力明显降低,中高剂量DEHP(25、50、100、200μmol/L)暴露后更加显著抑制细胞增殖活力。Transwell结果分析发现,高糖组的迁移能力明显大于正常组。与高糖组相比,随着DEHP暴露剂量的增加,下室中足细胞的数量也明显增加。流式数据显示,高葡萄糖刺激的足细胞产生的ROS比正常组显著增多,与高糖组相比,随着DEHP(50,200μmol/L)的暴露,ROS的产生也明显增加。6.DEHP对高糖刺激的足细胞中P-p38、P-p65和podocin蛋白表达的影响免疫荧光和qRT-PCR结果分析发现,相比于正常组,高糖刺激下的podocin蛋白水平明显下降。与高糖组相比,50和200μmol/L DEHP组的podocin蛋白水平明显下降,12.5μmol/L组无明selleck SAG显变化。WB结果显示,体外实验结果总体趋势与体内基本一致。DEHP能明显增加P-p38和P-p65蛋白水平,显著降低podocin蛋白水平。结论:1.DEHP加重HFD联合STZ诱导的小鼠糖尿病肾病。DEHP会升高肾指数,加重肾损伤,促进足细胞ROS产生,可能与促进炎症反应和加重氧化应激等机制有关。2.DEHP加重DN可能与介导氧化应激和激活P38MAPK/NF-κB信号通路有关。在一系列的动物和细胞实验中,论证了DEHP暴露增加了氧化应激指标的水平,上调了通路相关蛋白P-p38、P-p65的蛋白表达。提示DEHP可能通过P38MAPK/NF-κB加重DN。