目 的:1.建立薄层色谱自动分析方法,利用计算机图像分析技术,对不同来源远志药材薄层色谱结果进行分析,为远志真伪鉴别准确www.selleck.cn/products/gw4869性和质量等级自动分析评价提供参考。2.筛选远志提取方法,确定大孔吸附树脂法制备DISS部分的工艺条件,为远志活性部分研究提供支持。3.筛选远志(Polygalae Radix)不同部分对CORT损伤SH-SY5Y细胞的保护作用,并探讨远志DISS部分对SH-SY5Y细胞LDH、ROS、MMP等指标的影响。对DISS部分保护作用机制进行研究,为远志治疗抑郁症的药效机制研究提供支持。4.探讨DISS部分对低氧培养环境下CORT损伤SH-SY5Y细胞的保护作用,及对ROS、MMP等指标的影响。对低氧下DISS部分保护作用机制进行研究,为远志治疗抑郁症的药效机制研究提供支持。材料与方法:1.采用薄层色谱法对18种不同远志样品进行薄层色谱鉴别,通过自动分析方法对18个不同来源远志与远志对照药材进行相似度评价,并进行等级划分。2.采用75%乙醇对远志进行提取。通过大孔吸附树脂富集和不同浓度乙醇依次洗脱,采用HPLC法,以DISS为指标对不同洗脱Genetic exceptionalism液进行检测,确定洗脱条件。3.建立CORT损伤SH-SY5Y细胞模型,MTT法测定细胞活力。通过LDH释放试验检测LDH水平,通过试剂盒测定细胞内活性氧和线粒体膜电位的水平。采用Hoechst/PI双染法检测细胞凋亡水平,用钙离子试剂盒测定细胞内钙离子含量,用HPLC法对细胞内ATP、ADP、AMP、NAD含https://www.selleck.cn/products/Lapatinib-Ditosylate.html量进行测定,综合评价分析DISS部分对CORT损伤细胞的神经保护作用与机制。4.建立低氧CORT损伤SH-SY5Y细胞模型,MTT法测定细胞活力。通过荧光探针试剂盒测定细胞内活性氧和线粒体膜电位的水平。采用Hoechst33342/PI双染法对细胞凋亡进行检测。以ROT为对照,通过JC-1试剂盒测定细胞线粒体膜电位,分析低氧下DISS部分对CORT损伤细胞线粒体功能的保护作用机制。结 果:1.采用薄层色谱自动分析方法对18种不同来源远志样品进行筛选评价,鉴别出伪品小金牛草和17批远志药材。17批远志药材与对照药材的相似度均高于0.85,说明17批远志药材样品均一性较好。对17批远志药材进行等级划分:相似度大于0.93为一等品有4批、大于0.89为二等品有7批、大于0.85为三等品有6批。2.采用75%乙醇提取远志药材,通过AB-8大孔吸附树脂对药材提取液进行分离,其上样溶液质量浓度为0.6g/ml,最大上样体积为1.5BV,10%、40%的乙醇洗脱6BV,75%、95%乙醇洗脱4BV并收集洗脱液,洗脱流速为2BV/h。以DISS为指标,采用HPLC对远志不同部分进行检测。3.在DISS部分对CORT诱导的SH-SY5Y细胞活力作用研究中,CORT明显抑制细胞活力最小剂量是50μmol/L,最佳剂量是600μmol/L。DISS部分对细胞活力增长的影响在10、20、40mg/ml呈剂量依赖性,对CORT损伤细胞有明显保护作用,降低LDH水平,改善细胞损伤。通过活性氧和线粒体膜电位试剂盒检测,CORT损伤后细胞绿色荧光明显增加、红色荧光明显降低,经DISS部分给药干预后,绿色荧光由强转弱、红色荧光由弱转强,说明DISS部分能够明显改善CORT损伤细胞ROS水平,增强线粒体膜电位的表达。Hoechst33342/PI双染法发现DISS部分能够改善CORT诱导细胞凋亡及坏死情况。表明DISS部分能够降低CORT引起细胞钙离子内流情况。通过HPLC法检测细胞内ATP、A DP、AMP、NAD含量,CORT损伤后,细胞内四种成分含量明显下降,经DIS S部分治疗干预后,细胞内成分均有不同程度改善。DISS部分可显著提高CORT损伤细胞活力,对CORT和ROT共同损伤细胞无明显作用;经JC-1荧光探针试剂盒检测,DISS部分可显著提高CORT损伤细胞线粒体膜电位,对CORT和ROT共同作用损伤细胞线粒体膜电位无显著影响。4.在低氧损伤SH-SY5Y细胞活力研究中,低氧显著降低细胞活力的时间为8h。通过ROS和MMP试剂盒检测,经DISS部分给药干预后,绿色荧光由强转弱、红色荧光由弱转强,表明DISS部分能够明显改善低氧状态下CORT引起的ROS水平上升和线粒体膜电位下降。通过Hoechst/PI双染法检测,DISS部分能够改善低氧状态下CORT损伤细胞凋亡及坏死情况。5.低氧状态下,对DISS部分干预CORT、ROT共同损伤SH-SY5Y细胞的线粒体膜电位进行测定,经JC-1线粒体膜电位试剂盒检测后可知,低氧状态下DISS部分可显著提高CORT损伤SH-SY5Y细胞的线粒体膜电位,对CORT、R OT共同损伤SH-SY5Y细胞的线粒体膜电位无显著影响。结 论:1.建立一种新的薄层色谱自动分析方法并对远志薄层色谱进行结果检识,比较分析18批不同来源远志药材并对其进行等级划分,共划分为三等,为远志药材的鉴定及评价提供研究支持。2.采用AB-8大孔吸附树脂对远志提取液进行分离,分别用10%、40%、75%、95%乙醇进行洗脱,其中DISS部分对CORT损伤SH-SY5Y细胞具有保护作用,作用机制为DISS部分抑制CORT引起的细胞活力下降、氧化应激损伤、细胞凋亡、钙离子内流以及降低细胞内ATP、ADP、AMP、NAD含量等。DIS S部分可通过线粒体途径对CORT损伤细胞进行保护。3.在低氧状态下,DISS部分对CORT损伤SH-SY5Y细胞具有保护作用,抑制低氧与CORT共同损伤所引起的细胞活力下降、氧化应激损伤、细胞凋亡等,具有显著保护作用。DISS部分可通过线粒体途径对低氧和CORT共同损伤细胞进行保护。